Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в кишечной неврологии и физиологии желудочно-кишечного тракта, такие как, каковы механизмы возбудимости клеток энтерохромафина и реакция на светящиеся раздражители, и каковы механизмы высвобождения желудочно-кишечного гормона? Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет детально изучать энтерохромафиновые клетки с использованием одноклеточных методов, таких как электрофизиология. Демонстрацией процедуры будут соавторы Кейтлин Кнутсон и Питер Стреге, выдающиеся технологи, которые разработали эти методы.
Чтобы начать эту процедуру, поместите шестими миллилитровую шприц-иглу, наполненную ледяным PBS, в люмен извлеченного кишечного сегмента. Используйте микродиссекционные типсы, зажим и печать кишечника вокруг иглы шприца, и осторожно промыть шесть миллилитров PBS через люмен, чтобы смыть любые фекалии. Далее, инвертировать кишечную ткань, мягко ткачество микродиссеции щипцы через люмен, щипать стенки кишечника, и втягивания ткани проксимальной до кончика щипцы.
Повторите этот процесс до тех пор, пока сегмент не выйдет наизнану с люменом наружу. Используя ножницы микроперегибки, разрежьте сегменты тканей на односантиметровые кусочки. Затем перенесите сегменты тканей в 50-миллилитровый стакан, наполненный пятью миллилитров стерильных PBS.
Впоследствии, фарш части ткани для сликовой консистенции. Перенесите рубленую ткань и 15 миллилитров ледяного PBS в чистую 50-миллилитровую трубку. Тритурат два раза с передачей пипетки.
Подождите, пока ткань успокоится. После этого удалите 15 миллилитров супернатанта PBS и замените свежим PBS. Повторите этот процесс три раза, пока PBS не будет ясен.
Для первого пищеварения, из водяной ванны, получить один из 50-миллилитровых труб, содержащих 10 миллилитров предварительно разогретых средств пищеварения. Затем добавьте 250 микролитров раствора коллагеназы PBS в трубку с рублеными кусочками кишечника. Наконец, рубленые кусочки кишечной ткани были добавлены в средства пищеварения и раствор коллагеназы PBS.
Затем поместите образец в водяную баню на пять минут при 37 градусах по Цельсию. Медленно титровать ткани один раз с 10-миллилитровой серологической пипетки и кратко пусть части ткани оседают. Используйте передачу пипетки, чтобы удалить 10 миллилитров супернатанта.
Для второго пищеварения добавьте в ткань 250 микролитров раствора коллагеназы PBS и поместите его в водяную баню при 37 градусах Цельсия. После этого медленно титровать раствор один раз с 10-миллилитровым серологическим пипеткой. Затем удалите 10 миллилитров супернатанта.
Для третьего пищеварения добавьте в трубку 250 микролитров раствора коллагеназы PBS. Поместите его в 37-градусную ванну с водой по Цельсию в течение 10 минут. Затем встряхните трубку два-три раза в минуту с более высокой интенсивностью, чем пищеварения один и два.
Впоследствии, медленно pipette ткани вверх и вниз с 10-миллилитровой серологической пипетки и позволяют части ткани, чтобы поселиться в течение короткого времени. Перенесите 10 миллилитров супернатанта в новую 15-миллилитровую трубку. Добавить два миллилитров разогретой ячейки ЕС полной культуры средств массовой информации и инвертировать один раз, чтобы смешать.
Затем вращаем образец при температуре 100 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут снимите супернатант и повторно приостановите оставшиеся гранулы в 2,5 миллилитров разогретой клетки EC полной культуры. Для четвертого пищеварения, повторить процедуры пищеварения, но увеличить инкубационные время на 15 минут для толстой кишки, и остаются на 10 минут для jejunum.
Чтобы культурировать клетки, используйте пересадочную пипетку, чтобы объединить клеточные суспензии, собранные из пищеварения, три и четыре в новую 15-миллилитровую трубку. Удалите 10-микролитровую алицита клетки и подсчитайте с помощью гемоцитометра. Затем вращаем оставшуюся подвеску клетки при 100 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Через пять минут удалите супернатант и добавьте ЭК-клетки полного культурного мультимедиа с помощью серологического пипетки 5-миллилитров при плотности одного миллиона клеток на миллилитр. Повторно приостанавливайте ткань с помощью переносной пипетки. Впоследствии, удалить покрытием стеклянного дна культуры блюда из инкубатора.
Используя пипетку P1000, замените дополнительную сотовую матрицу от каждого культурного блюда 250 микролитров окончательной клеточной подвески. Для достижения гигазема всей клетки, опустите электрод в раствор ванны. С помощью микроманипулятора маневрируете наконечником электрода в плоскости с и непосредственно горизонтальной от клетки.
Затем изгнать 0,2 миллилитров воздуха из шприца. Аккуратно переместите электрод горизонтально вдоль оси X, чтобы коснуться ячейки. Следите за ямочка появляться на клетке ЕС, и увеличение мембранной устойчивости на уплотнение испытаний.
Нанесите на шприц от 0,1 до 0,2 миллилитров всасывания и удерживайте поршень устойчивым до достижения 100 мега-ом. Затем отпустите сцепление с поршенем. Подождите, пока клетка гигаселья.
Затем аккуратно отключите шприц. Для записи цельноклеточного напряжения закрытого тока натрия, нанесите быстрый кран всасывания на шприц. Повторяйте до тех пор, пока весь доступ к ячейке не будет достигнут, прежде чем аккуратно отключить шприц.
Затем включите компенсацию емкости всей ячейки и отрегулируйте сопротивление емкости и рядов. Включите компенсацию сопротивления серии. При лаге, установленном на уровне 60 микросекунд, отрегулируйте компенсацию сопротивления серии и закройте тест уплотнения.
Запись в среднем пять работает цельноклеточного напряжения ворот натрия тока. Быстро принять к сведению два параметра напряжения закрытого тока натрия: напряжение в оконном токе, и пик плотности тока натрия. Чтобы записать вызываемые потенциалы действий, переключитесь режим с зажима напряжения на текущий зажим.
Загрузите эпизодический текущий протокол зажима. Отрегулируйте ток холдинга до нуля пикоамп здесь и включите внешнюю команду. Запись вызываемых потенциалов действий.
Обратите внимание на наименьшее количество тока, вводимого для с огня от потенциала действий. Для записи спонтанных потенциалов действий выключите внешнюю команду. Загрузите протокол зажима без пробелов.
Измените ток холдинга на количество тока, введенного в последней развертке в вызываемом протоколе, который не вызвал потенциал действия. Затем включите внешнее командование. Двойная проверка того, что прогнозируемый ток холдинга приносит мембранный потенциал ниже порога, чтобы зажечь потенциал действия.
При необходимости отрегулируйте ток холдинга и завемите спонтанную активность. Культуры, оптимизированные для электрофизиологии, состояли из одиночных клеток и небольших скоплений с ярким сигналом CFP. Когда культурные условия не были оптимизированы, эпителиальная культура клеток состояла из больших скоплений, плавающего клеточного мусора, поврежденных мембран и слабого сигнала CFP в клетках ЕС.
EC целые клетки были получены на 30 плюс-минус 7% попыток из толстой кишки культур, и 41 плюс-минус 3% попыток из jejunum культуры. По всеклеточной электрофизиологии, токи натрия были зарегистрированы от 81,3 плюс-минус 4,0% TPH-1 CPF положительных клеток из jejunum и 64,1 плюс-минус 9,2% из них из толстой кишки. Из 59 клеток ЕС из jejunum культур, 19 клеток ЕС в текущем режиме зажима выстрелил спонтанно AP, 29 клеток ЕС выстрелил AP только тогда, когда вызвали шаг протокола в текущем режиме зажима, и 11 клеток ЕС не огонь AP спонтанно или по шагу протокола.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что оптимальный протокол пищеварения для первичных эпителиальных культур может быть переменным между использованиями, поэтому важно определить оптимальное количество агитации для получения отдельных клеток. После этой процедуры, другие методы, как одноклеточный ПЦР и флуоресценция, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как то, что enterochromaffin клетки выражают и как стимулы связаны с межклеточной сигнализации. После этого развития, этот метод проложил путь для исследований в желудочно-кишечной физиологии, чтобы исследовать, как энтерохромафин клетки работают и как они регулируют подвижность желудочно-кишечного тракта и секреции у мышей.
