Этот протокол ввел определенный метод фидерных клеток для дифференциации роговицы лимбальных эпителиальных стволовых клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Лимбальные эпителиальные стволовые клетки отвечают за обновление эпителиального роговицы в здоровом глазу. Повреждение этих клеток приводит к состоянию, известному как дефицит лимбальных стволовых клеток, и к потере ясности роговицы.
Методы клеточной культуры, показанные здесь, позволяют эффективное производство лимбальных эпителиальных стволовых клеток для будущей заместительной терапии клеток роговицы. Для начала, прохождение и поддержание подачи свободной человеческой плюрипотентной культуры стволовых клеток, как указано в текстовом протоколе. Убедитесь в том, чтобы использовать только высокое качество человеческих плюрипотентных стволовых клеток в качестве исходного материала для дифференциации.
Когда вы будете готовы вызвать образование эмбрионального тела, подогрейте все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока. Отсоедините фидер свободных человеческих плюрипотентных стволовых клеток к подвеске, добавив 500 микролитров xeno бесплатно трипсина EDTA к каждой хорошо. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию, с 5%CO2.
Через три минуты удалите клетки из инкубатора и проверьте морфологию клеток, чтобы определить оптимальную фазу для удаления трипсина. Внимательно наблюдайте за клетками, чтобы определить оптимальное время для удаления xeno free tryspin EDTA, когда клетки округляются, но не отсоединяются полностью. В оптимальное время удалите из клеток ксено свободный трипсин ЭДТА.
Добавьте определенный ингибитор трипсина и аккуратно пипетки, чтобы отделить клетки. Соберите одноклеточную подвеску в 50-миллилитровой центрифуге. Центрифуга при 300г в течение пяти минут.
Затем удалите супернатант и повторно посовелите клетки в один миллилитр культурной среды. После подсчета клеток, распределить от двух до трех миллионов клеток в трех миллилитров базальной индукционной среды дополняется пятью микромолярной blebbistatin к каждому колодец низкой крепления шесть пластины хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.
На следующий день проверьте качество эмбриональных тел под микроскопом. Удалите среду и замените ее тремя миллилитров базальной индукционной среды, дополненной 10 микромоларными SB-505124 и 50 нанограммами на миллилитр основного фактора роста стекловолокна человека. Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.
Следующие два дня удалите среду и замените ее тремя миллилитров базальной индукционной среды, дополненной 25 нанограммами на миллилитр костного морфогенетического белка четыре. Затем продолжайте инкубацию, используя предыдущие условия. На четвертый день приготовьте смесь 0,5 микрограмма на квадратный сантиметр ламинина-521 и пять микрограммов на квадратный сантиметр плацентарный коллаген человеческого типа четыре, разбавленного в DPBS, содержащего кальций два и магний два иона.
Используя эту смесь, покрыть 100 миллиметров ткани культуры блюда для адепта дифференциации в общем объеме покрытия пять миллилитров на блюдо. Печать пластин, и хранить их при четырех градусах по Цельсию на ночь. На пятый день прогреть все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока.
После этого снимите раствор покрытия и добавьте к каждому блюду 10 миллилитров предварительно разогретой дифференциации. Используя пипетки, перенесите эмбриональные тела из одной пластины хорошо через две-три ткани культуры блюд. Затем аккуратно встряхните каждое блюдо культуры, чтобы равномерно распределить эмбриональные тела.
Поддерживайте клетки в адептской культуре при 37 градусах Цельсия с 5%CO2 в течение следующих двух с половиной-трех недель, убедившись, что заменить средний с 10 миллилитров свежей дифференциации среды три раза в неделю. Используйте фазовый контрастный микроскоп, чтобы регулярно проверять клетки на наличие правильной эпителиальной морфологии. Для начала предварительно разогреть все необходимые материалы и реагенты до комнатной температуры в ламинарной капюшоне потока, за исключением криоконсервации среды, которая должна быть предварительно охлажденной.
Затем отсоедините плюрипотентную стволовую клетку человека, полученную лимбальными эпителиальными стволовыми клетками, к одноклеточной суспензии, добавив ксено свободный трипсин EDTA и инкубации при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2. Через пять минут удалите клетки из инкубатора и проверьте морфологию клеток, чтобы определить оптимальную фазу для удаления трипсина. Внимательно наблюдайте за клетками, чтобы определить оптимальное время для удаления ксено свободного трипсина ЭДТА, когда клетки округлены, но не отделились полностью.
В оптимальное время, удалить ксено свободной трипсина EDTA из клеток, и отделить клетки, как описано ранее. После подсчета клеток, центрифуга их на 300г в течение пяти минут. Аспирировать среды, и повторного перерасхода клеток в предварительно охлажденной ксено свободной криоконсервации среды.
Используя пипетку, перенесите одноклеточную подвеску в криотрубы, чтобы каждая криотрубка содержит от 500 000 до одного миллиона клеток в одном миллилитре криоконсервации среды. Поместите трубки в замораживающий контейнер. В течение пяти минут, передать их в морозильную камеру при отрицательном 80 градусов по Цельсию для ночного хранения.
На следующий день перенесите трубки в жидкий азот для длительного хранения. Перед оттаиванием клеток, покрыть все необходимые блюда и пластины скважины со смесью из пяти микрограммов на квадратный сантиметр человеческого плацентарного коллагена типа четыре, и 0,5 микрограмма на квадратный сантиметр LM-521, и предварительно разогреть все необходимые материалы и реагенты для комнатной температуры в ламинарном потоке капота. Затем снимите раствор покрытия с посуды и пластинных колодцев и добавьте соответствующий объем предварительно разогретой дифференциации среды.
Добавьте предварительно разогретую дифференциацию в 15-миллилитровую коническую трубку. Оттепель клетки быстро комнатной температуры. После размораживания немедленно перенесите подвеску клетки в коническую центрифугу.
Центрифуга при 300г в течение пяти минут. Аспирировать среды, и повторно использовать ячейки гранулы в дифференциации среды для удаления любых криоконсервации среды. Плита клеток на предварительной посуды в дифференциации среды при плотности от 40000 до 50000 клеток на квадратный сантиметр.
Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия при 5%CO2, заменяя дифференциацию средой три раза в неделю. На Laminin-521 недифференцированная высококачественная кормушка, свободная от плюрипотентных стволовых клеток человека, сначала образуют различные колонии с острыми краями, которые сливаются с однородными монослойами при слиянии. Культивирование в базальной индукционной среде, дополненной пятью микромолейными блеббистатином в течение 24 часов, как правило, производит суспензию плотных, регулярных эмбриональных тел различных размеров, в то время как эмбриоидная морфология тела не должна резко меняться во время поверхностной эктодермальной индукции в суспензии, колониальный нарастание, как видно, появляется вскоре после того, как эмбриональные тела появляются на коллагене типа 4 и Laminin-521.
В течение 21-25 дней дифференциации клетки образуют стеченные однородные слои с полигональной морфологией, что характерно для эпителиальных клеток. Клетки могут быть затем крио хранится для более длительного использования, как жизнеспособность и морфология хорошо сохранились после оттаивания. На 24-й день дифференциации, подавляющее большинство клеток выразили пару белка коробки, PAX6, ключевой регулятор развития глаз, а также p63 альфа, широко признанный маркер LESC.
Дельта Np63 coexpressed в большинстве p63 альфа-положительных клеток, подтверждающие наиболее роговицы конкретных дельта Np63 альфа положительный фенотип клеток. Другие маркеры выражены частично, в то время как другие необнаружимы на данный момент, указывая дифференциации продвинулась в направлении однопотентных лимбальных эпителиальных прародителей, но терминальная дифференциация в зрелых эпителиальных клеток роговицы еще не произошло. В среднем, каждая недифференцированная фидер свободной человеческой плюрипотентной стволовой клетки генерирует 0,7 клеток в день 25.
По крайней мере 65%delta Np63 альфа положительной популяции клеток можно ожидать к 24-му дню. Криоконсервация еще больше очищает популяцию клеток. В целом, методы, представленные здесь, относительно просты, но есть несколько критических моментов к успеху.
Высокое качество исходного материала имеет важное значение, а также нежные, свободно методы клеточной культуры в целом. Этот протокол обеспечивает надежные средства для производства лимбальных эпителиальных стволовых клеток для клинического применения, а также для различных исследовательских целей. Кроме того, метод можно легко модифицировать для дифференциации пигментных эпителиальных клеток сетчатки.
