La purificazione dell'F1-ATPasi si basa su un classico metodo biochimico che si è rivelato cruciale per la nostra comprensione del meccanismo di produzione di ATP da parte di altre sintasi ATP. Il principale vantaggio di questa tecnica è che produce un enzima altamente puro adatto alla determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o microscopia crioelettica. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per l'isolamento dell'F1-ATPasi dai tripanosomi, può essere adattato ad altre fonti, come cellule tissutali o di coltura, e a vari protisti patogeni.
Questa tecnica può portare all'identificazione di nuovi farmaci per il trattamento di gravi malattie umane. Ad esempio, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase è un obiettivo farmacologico autenticato per il trattamento della tubercolosi. Per iniziare il protocollo, scongelare e rimescolare delicatamente le vescicole mitocondriali, note anche come mitoplasti, precedentemente isolate dalla lisi ipotonica da una per 10 all'11-2 per 10 alle 11 cellule del prociclico Trypanosoma brucei in cinque millilitri di tampone A ghiacciato.Mantenere il campione refrigerato.
Successivamente, determinare la concentrazione proteica nella sospensione da parte dell'acido bicinconico, o BCA, test proteico secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una serie di diluizioni BSA in acqua ultra pura per costruire la curva standard. Diluire una piccola quantità del campione da 20 a 100 volte con acqua ultra pura per adattarsi alla gamma degli standard BSA.
Dopo aver calcolato la quantità totale di proteine nel campione, portare la concentrazione proteica a 16 milligrammi per millilitro diluerla con tampone A aggiuntivo.Quindi frammentare i mitoplasti in vescicole invertite e pezzi di membrana per sonicazione sette volte per 15 secondi ciascuno, con un'energia totale da 70 a 100 joule per impulso con un microtip con un diametro di 3,9 millimetri. Durante la ingmatura, incubare il campione sul ghiaccio per 30 secondi tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, la sospensione potrebbe apparire leggermente più scura.
Sedimentare i frammenti della membrana per ultracentrifugazione a 54.000 g per 16 ore o a 98.000 g per cinque ore a quattro gradi Celsius. Decantare il supernatante e procedere con l'estrazione cloroformio. Calcolare il volume del buffer B in base alla quantità totale di buffer A utilizzata.
Trasferire il sedimento congelato dal tubo di centrifuga nell'omogeneizzatore. Rimescolare il pellet delle membrane mitocondriali nel tampone B con l'aiuto di un piccolo omogeneizzatore Dounce. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri.
Rimuovere il campione dal ghiaccio e mantenere il campione e tutte le soluzioni a temperatura ambiente per i passaggi rimanenti. Quindi aggiungere cloroformio saturo di due tris molare regolati con HCl a pH 8,5, uno a uno. Chiudere saldamente il cappuccio e agitare vigorosamente il campione per esattamente 20 secondi.
Centrifugare immediatamente la miscela a 8.400 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire la fase acquosa superiore e torbosa su microtubi da 1,6 millilitri. Aggiungere inibitori della proteasi al campione per sostituire gli inibitori rimossi dal trattamento cloroformio.
Centrifugare i campioni a 13.000 g per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo lo spin, trasferire il supernatante su microtubi freschi e ripetere la centrifugazione per rimuovere qualsiasi materiale insolubile rimanente. Equilibrare la colonna Q di scambio ionico a cinque millilitri attaccata a un sistema di cromatografia liquida a proteine veloci con 50 millilitri di buffer di colonna Q ad una portata di cinque millilitri al minuto fino a quando l'assorbanza a 280 nanometri e la conduttività si stabilizzano.
Caricare il supernatante sulla colonna equilibrata ad una portata di un millilitro al minuto. Attendere che l'assorbanza a 280 nanometri si stabilizzi sullo sfondo. Applicare un gradiente lineare di 25 millilitri del buffer di eluizione della colonna Q dallo 0% al 100% a una portata di 0,5 millilitri al minuto e raccogliere una frazione millilitro.
Saggio 10 microlitri di ogni singola frazione corrispondenti al picco di eluizione maggiore per l'attività idrolitica ATP per millilitro di miscela di reazione da parte del saggio Pullman ATPase a pH 8.0. Mettere in comune le frazioni che mostrano l'attività ATPase. Concentrare il campione raggruppato per ultrafiltrazione a membrana utilizzando una colonna di spin con un filtro PES tagliato a peso molecolare da 100.000 a 200-500 microlitri.
Quindi procedere alla cromatografia di esclusione delle dimensioni. Equilibrare la colonna Superose 6 Increase collegata a un sistema di cromatografia liquida con almeno 48 millilitri di tampone SEC ad una portata di 0,5 millilitri al minuto. Applicare l'esempio alla colonna.
Eseguire la cromatografia a una portata di 0,25 millilitri al minuto, mentre si raccolgono frazioni di 0,25 millilitri. Successivamente, eseguire 10 microlitri delle frazioni che corrispondono ai picchi della traccia di assorbanza UV 280 nanometrica su SDS-PAGE. Quindi macchiare i campioni con Coomassie Blue.
Saggio le frazioni corrispondenti al primo picco maggiore contenente il picco di F1 per l'attività idrolitica ATP e la sensibilità all'azide da parte del saggio Pullman ATPase. Quindi eseguire un test BCA per determinare la concentrazione proteica. Infine, mantenere l'F1-ATPasi purificato a temperatura ambiente e utilizzarlo entro tre giorni dalla purificazione per le applicazioni a valle.
Questo profilo di eluizione di una cromatografia a scambio di anioni mostra l'assorbanza UV a 280 nanometri e la concentrazione di cloruro di sodio nel tampone di eluizione. Le frazioni selezionate sono state separate sul gel SDS-PAGE e macchiate con colorante Coomassie Blue. Le frazioni che corrispondono al picco di eluizione maggiore dalla cromatografia a scambio ionico e contengono l'F1-ATPasi sono state raggruppate, concentrate e utilizzate come input per la cromatografia ad esclusione di dimensioni.
Il principale contaminante è la diidrolipoil deidrogenasi, che eluisce dalla colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni come picco discreto. L'F1-ATPasi eluisce nel primo picco dominante, in gran parte simmetrico. La colorazione Blu Coomassie di un tipico modello di banda dopo la separazione dell'F1-ATPasi purificata tramite SDS-PAGE mostra sporadiche bande deboli visibili sopra la subunità beta, che rappresentano sottocomplessi dell'alfa tre beta tre copricapo, dimeri e oligomeri delle subunità alfa e beta, e sono privi di contaminanti rilevabili dalla spettrometria di massa.
Durante l'esecuzione dell'estrazione cloroformio, fase critica del protocollo, è essenziale scuotere vigorosamente il campione e procedere immediatamente alla separazione centrifuga delle fasi organica e acquosa. Seguendo questa procedura, l'F1-ATPasi isolata può essere caratterizzata in dettaglio da spettrometria di massa. Inoltre, può essere utilizzato nei test di attività o per studi strutturali, da solo o in presenza di vari inibitori o analoghi del substrato.
