F1-ATPase의 정제는 다른 ATP 신디사이저에 의해 ATP 생산메커니즘의 우리의 이해에 매우 중요한 것으로 입증 된 고전적인 생화학 적 방법을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 X 선 결정학 또는 극저온 현미경 검사법에 의한 구조 결정에 적합한 매우 순수한 효소를 생성한다는 것입니다. 이 프로토콜은 trypanosomes에서 F1-ATPase의 격리에 최적화되어 있지만, 조직 또는 배양 세포와 같은 다른 소스와 다양한 병원성 선신에 적응할 수 있습니다.
이 기술은 가혹한 인간적인 질병을 취급하기 위하여 새로운 약의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다. 예를 들어, 진균 결핵 F-ATPase는 결핵의 치료를 위한 인증된 약물 표적이다. 프로토콜을 시작하기 위해, 해동하고 부드럽게 미토콘드리아 소포를 다시 중단, 또한 미토콘라스로 알려진, 이전에 한 번 10에서 11 에 2 번 10에 11 에서 11 에 2 번 10 에 얼음 차가운 버퍼 A.의 5 밀리리터에 있는 미토콘드리아 소포를 다시 중단하십시오.
다음으로, 제조사의 지시에 따라 비신천산 또는 BCA, 단백질 분석에 의한 현탁액의 단백질 농도를 결정한다. 표준 곡선을 구성하기 위해 초순수 수에서 BSA 희석 계열을 수행합니다. BSA 표준의 범위에 맞게 초순수물로 소량의 샘플을 20~100회 희석시 희석시.
시료의 총 단백질 양을 계산한 후, 추가 버퍼 A.다음 마이크로플라스트를 15초 동안 7회 씩 소닉하여 반전된 소포와 멤브레인 조각으로 조각하여 밀리리터당 16밀리그램으로 단백질 농도를 가져와, 직경 이 3.9mm의 마이크로 팁으로 충동당 총 에너지70~100줄의 에너지를 섭취한다. 조각화하는 동안, 충동 사이의 30 초 동안 얼음에 샘플을 인큐베이션. 초음파 처리 후 서스펜션이 약간 더 어둡게 보일 수 있습니다.
퇴적물 54에서 초음파 심립분리에 의해 멤브레인 파편, 16 시간 동안 000 g 또는 섭씨 4도에서 5 시간 동안 98, 000 g. 상류제를 데칭하고 클로로폼 추출을 진행한다. 사용된 버퍼 A의 총 양을 기준으로 버퍼 B의 볼륨을 계산합니다.
원심분리기 튜브에서 균질화로 냉동 퇴적물을 옮기. 버퍼 B의 미토콘드리아 막의 펠릿을 작은 두스균제의 도움으로 재중단합니다. 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮는다.
얼음에서 샘플을 제거하고 샘플과 모든 솔루션을 실온에서 유지하여 나머지 단계를 수행합니다. 그런 다음 HCl으로 조정된 두 개의 어어 트리로 포화된 클로로폼을 pH 8.5, 1대 1로 추가합니다. 캡을 단단히 닫고 정확히 20초 동안 샘플을 힘차게 흔들어 줍니다.
즉시 실온에서 5 분 동안 8, 400g에서 혼합물을 원심 분리합니다. 다음으로, 상부, 흐린 수성 위상을 1.6 밀리리터 마이크로튜브로 옮기. 클로로폼 처리에 의해 제거된 억제제를 대체하기 위해 시료에 프로테아제 억제제를 첨가한다.
원심 분리는 실온에서 30 분 동안 13, 000g에서 샘플을 원심 분리합니다. 스핀 후, 상체를 신선한 마이크로튜브로 옮기고 원심분리를 반복하여 남은 불용성 물질을 제거합니다. 280나노미터의 흡수도가 안정될 때까지 분당 5밀리리터의 유속으로 50밀리리터의 Q 컬럼 버퍼를 가진 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 5밀리리터 음이온 교환 Q 컬럼을 상형화한다.
평형 컬럼에 분당 1밀리리터의 유량으로 상체를 적재합니다. 280 나노미터의 흡광도가 백그라운드에서 안정될 때까지 기다립니다. 분당 0.5 밀리리터의 유량으로 Q 컬럼 용출 버퍼의 25 밀리리터 선형 그라데이션을 0%에서 100%로 적용하고 1밀리리터 분획을 수집합니다.
분석 10 pH 8.0에서 풀만 ATPase 분석에 의해 반응 혼합물의 밀리리터에 대한 ATP 가수분해 활성에 대한 주요 용출 피크에 대응하는 각 개별 분획의 마이크로리터. ATPase 활동을 나타내는 분수에 풀을 이수합니다. 100, 000 분자량 차단 PES 필터를 200 내지 500 마이크로리터로 스핀 컬럼을 사용하여 멤브레인 울트라 여과에 의한 풀이 된 샘플을 농축한다.
그런 다음 크기 배제 크로마토그래피를 진행합니다. 분당 0.5 밀리리터의 유량으로 SEC 버퍼의 최소 48 밀리리터와 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 Superose 6 증가 컬럼을 평형화합니다. 샘플을 열에 적용합니다.
0.25 밀리리터 분획을 수집하는 동안 분당 0.25 밀리리터의 유량으로 크로마토그래피를 실행합니다. 다음으로, SDS-PAGE에서 UV 280 나노미터 흡광도 추적의 피크에 해당하는 분획의 10마이크로리터를 실행한다. 그런 다음 쿠마시 블루로 샘플을 얼룩지게합니다.
분석하여 풀만 ATPase 분석에 의한 ATP 가수분해 활성 및 아지드 감도에 대한 F1 피크를 포함하는 첫 번째 주요 피크에 해당하는 분획을 말합니다. 그런 다음 BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 결정합니다. 마지막으로, 정화된 F1-ATPase를 실온에서 유지하고 다운스트림 응용 제품에 대한 정화 후 3 일 이내에 사용합니다.
음이온 교환 크로마토그래피의 이러한 용출 프로파일은 용출 완충제에서 280 나노미터 및 염화나트륨 농도에서 UV 흡광도를 표시합니다. 선택된 분획은 SDS-PAGE 젤에 분리되고 쿠마시 블루 염료로 염색되었습니다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 의 주요 용출 피크에 대응하고 F1-ATPase를 포함하는 분획은 풀레이션, 농축 및 크기 배제 크로마토그래피를 위한 입력으로 사용되었다.
주요 오염 물질은 디하이드로리포일 탈수소효소로, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 이산 피크로 엘레우트합니다. F1-ATPase는 첫 번째 지배적 인 대칭 피크에서 엘utes. SDS-PAGE를 통해 정제된 F1-ATPase를 분리한 후 전형적인 밴드 패턴의 쿠마시 블루 염색은 베타 서브유닛 위에 보이는 산발적인 약한 밴드를 나타내며, 이는 알파 3개의 베타 세 헤드피스, 알파 및 베타 서브유닛의 아편, 디머 및 올리고머의 서브콤함을 나타내며, 질량에 의한 오염 물질 검출이 없는 다.
클로로폼 추출을 수행하는 동안, 프로토콜의 중요한 단계는, 시료를 적극적으로 흔들고 유기 및 수성 상의 원심 분리를 즉시 진행하는 것이 필수적이다. 이 절차에 따라 격리된 F1-ATPase는 질량 분석법에 의해 자세히 특성화될 수 있습니다. 또한, 활동 적 시도 나 구조 연구에 사용할 수 있습니다., 자체적으로 또는 다양 한 억제제 또는 기판 아날로그의 존재.
