Система культуры органов кишечника сочетает в себе преимущества анализов in vitro и in vivo и, таким образом, служит промежуточным экспериментальным этапом между простыми анализами in vitro и сложными экспериментами in vivo. Основным преимуществом данной методики является сочетание жесткого экспериментального контроля с сохранением физиологии кишечника. Этот метод дает представление об анализе реакций кишечника на конкретный стимул с высоким уровнем контроля над компонентами хозяина, микробами и окружающей среды.
Продемонстрировать процедуру будут Алон Шемеш, студент магистратуры из моей лаборатории, и доктор Сиван Амидрор, наш руководитель лаборатории. Для начала вставьте тупые иглы в соответствующее положение внутри формы устройства и отлить примерно 20 граммов полидиметилсилоксана или смеси PDMS для одного комплекта устройства и крышки. Поместите формы в вакуумную камеру на 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси PDMS, затем инкубируйте формы при 55 градусах Цельсия в течение ночи для завершения полимеризации PDMS.
Когда PDMS установлен, вытащите иглы из формы и осторожно отпустите устройство для культивовки и крышку из пластиковых форм. Удалите остатки PDMS из контура скважины с помощью хирургического лезвия. Прикрепите устройство PDMS и крышку устройства к покровному стеклу из микроскольщей 75 на 50 миллиметров с помощью нетоксичного кремниевого клея и оставьте детали для установки на ночь.
Нанесите клееный на гладкую сторону устройства. Вставьте иглы 12, 22 калибра для просвета и иглы 12, 18 калибра для колодца. Закрепите все иглы на месте с помощью силикона и дайте ему сложиться на ночь.
Очистите входные шприцы и убедитесь, что среда скважины вытекает из всех трубок в стакан для отходов, затем очистите входные шприцы и убедитесь, что стимуляция вытекает из всех трубок в стакан для отходов, заботясь о том, чтобы не загрязнять различные стимуляции. Пожертвовав мышью, используйте острые ножницы и щипцы, чтобы рассекнуть ее и вывести пищеварительный тракт из желудка в анус, разрезав все жировые и соединительные ткани. Вырежьте толстую кишку и поместите ее на новую пластину.
Минимизируйте контакт, удерживая ткань мягко и только по краям. Выполняют промывку толстой кишки под рассеченным микроскопом. Осторожно промыть содержимое толстой кишки стерильным IMDM с помощью приготовленного 10-миллилитрового шприца, как описано в тексте.
После удаления кала из кишечной ткани поместите толстую кишку в новую шестиплодную пластину, заполненную 0,5 миллилитрами стерильного IMDM. Далее берем ткань толстой кишки и аккуратно соединяем ее с иглой 22 калибра, делая плотную завязку двумя нитями. Поддерживайте правильную ориентацию толстой кишки к потоку просвета, так что проксимальный и дистальный равны входу и выходу соответственно.
Повторите промывку толстой кишки и подвязывание иглы для всех тканей. Подключите входную и выходную трубки к устройству, затем начните эксперимент с запуска насосов с нужными скоростями. Были обнаружены заполненные слизью камероскопические клетки в эпителии толстой кишки и секреция слизи в просвете, а также пролиферантная МЭК в криптах толстой кишки, о чем свидетельствует окрашивание KI67.
Эти результаты показали, что система кишечной культуры поддерживает функцию кишечника и структуру ex-vivo. После двух часов введения сегментированных нитевидных бактерий, или SFB, типичные нити SFB были обнаружены в тесной связи с ворсинками тонкой кишки с использованием флуоресцентной гибридизации in situ. Кроме того, просвечивающая электронная микроскопия представляла SFB в пределах нескольких микрон границы эпителия тонкой кишки.
Профили экспрессии генов образцов целых тканей были получены в трех количествах через два часа после инфузии SFB. Контрольные культуры наполняли фекальными суспензиями безмикробных или моноколонизированных мышей Bacteroides fragilis. Эти изменения, убежденные SFB, были в основном малой амплитуды по сравнению с контролем без микробов.
Ориентация толстой кишки очень важна. Особенно осторожности при завязывания толстой кишки на игле. Правильная стяжка предотвратит загрязнение лунки содержанием просвета.
Этому протоколу может следовать широкий спектр методов считывания, таких как секвенирование следующего поколения, визуализация, сортировка клеток и многое другое. Эти показания дают новое представление о взаимодействии микробиома хозяина в здоровье и болезнях.
