Основным преимуществом этого анализа является простота и точность, поскольку он не требует полоскания эмбриона для передачи в пищевой флакон, что позволяет избежать потерь от технических ошибок. Этот протокол не требует экспертных технических навыков. Тем не менее, надлежащее время и тщательная передача воды имеют важное значение для его точности и воспроизводимости.
Демонстрация этой процедуры будет Антонио Рокуэлл, недавно окончил аспирант из моей лаборатории. Перед началом процедуры налейте виноградный агар в 35-миллиметровую чашку Петри до половины полной и дайте агару затвердеть в течение одного часа. Когда агар затвердеет, используйте небольшой пластиковый нож, чтобы аккуратно поцарапать поверхность агара вокруг внешней стороны пластины, оставляя середину пластины свободной от царапин.
Затем поместите небольшое количество свежеприготовленной дрожжевой пасты в центр блюда и поместите блюдо в мини-клетку коллекции эмбрионов. Для сбора эмбрионов, первое место две девственные самки Drosophila и один молодой мужчина внутри клетки сбора в течение 24 часов. На следующий день осмотрите дно агарной пластины, чтобы найти эмбрионы.
Если эмбрионы были уложены, перенесите агарную пластину во влажную камеру и накройте ее крышкой, чтобы избежать обезвоживания. Если несколько дней укладки должны быть забиты, поместите новую пластину агара в клетку сбора. Используйте микроскоп, чтобы определить количество вылупившихся эмбрионов и личинок L1, и вернуть эмбрионы во влажную камеру при комнатной температуре, пока все эмбрионы не вылупились и не превратились в личинки L1.
После 48 часов подсчитайте количество вылупившихся эмбрионов и личинок L1 и используйте шпатель, чтобы тщательно удалить диск виноградного агара из чашки Петри, поместив диск L1 вниз на пищу в пищевой флакон достаточно большой, чтобы разместить диск. Затем внимательно осмотрите чашку Петри на оставшиеся личинки. Мониторинг пищевой флакон ежедневно примерно в то же время каждый день, чтобы подтвердить, что личинки L2 и L3 можно наблюдать, делая свой путь к пище.
Запись количество куколок и взрослых Drosophila, продолжая считать, пока не более взрослых наблюдаются и избежать подсчета последующего поколения. Затем выполните анализ чи-квадрата. Нулевая гипотеза предполагает 100%-ную жизнеспособность, так что число взрослых будет равно количеству вылупившихся эмбрионов и L1, первоначально записанных и перенесенных в пищевые флаконы.
Когда агар помещается на стороне флакона, многие эмбрионы и личинки не созревают для взрослых, вероятно, из-за обезвоживания диска виноградного агара. Когда виноградный агар помещается лицом вниз внутри флакона в непосредственном контакте с поверхностью пищи, менее 6% потомства, как правило, теряется, так как агар остается гидратированных в то время как в контакте с влагой мгновенной пищи внутри флакона. В этом репрезентативном эксперименте, сравнивая развитие дикого и мутантного потомства, примерно 91% потомства мутантов созрело до совершеннолетия, используя этот метод по сравнению с 94% потомства мух дикого типа.
Не забудьте перенести агар-диск эмбриона стороне вниз в пищевой флакон, а затем, чтобы проверить пустую чашку Петри для любых оставшихся личинок, которые не были переданы. Другим важным шагом является передача агар-диска в пищевой флакон не позднее чем через 48 часов после удаления виноградной агарной пластины из мини-клеток эмбриона для предотвращения обезвоживания.
