Неправильное сплочения белка Тау в его самосвечении в парные хелиные нити является патологическим признаком болезни Альцгеймера и других тауопатий. Здесь мы представляем надежный анализ агрегации Тау, который может помочь выяснить процесс патогенеза Тау. Преобразование следует за всеми шагами процесса полимеризации зависимых от ядра и является высоко воспроизводимым, что позволяет скрининг наркотиков в более строгом формате, который соответствовал уровню OBSI на сегодняшний день.
Качество реагентов имеет решающее значение. Рекомбинантный Тау должен быть очень чистым и лишенным агрегатов и фрагментов. Первый поворот на компьютере и мультимодной микроплекан считыватель.
После того, как оборудование стабилизируется, запустите программное обеспечение и выберите Стандартный протокол в качестве типа протокола. Установите температуру до 37 градусов по Цельсию и выберите подогрев перед продолжением протокола. Затем установите кинетическое время времени времени времени до 50 часов, а интервал измерения до 15 минут.
Установите орбитальную тряску до 425 циклов в минуту в непрерывном режиме. После этого выберите метод чтения в качестве флуоресцентной интенсивности конечных кинетических момохроматоров. Установите длину волны возбуждения до 440 нанометров и длину волны выбросов до 485 нанометров, положение оптики к началу, и увеличение до 80.
Выберите нормальную скорость чтения и установите высоту чтения до 4,50 миллиметров. Затем проверяйте и сохраните протокол. Запустите запуск с помощью созданного протокола.
Назовите эксперимент, выберите пункт назначения вновь созданного файла и позвольте прибору предварительно уравнять до нужной температуры. Для спонтанного рекомбинантного эксперимента по преобразованию Тау подготовь 1000 микролитровых реакций с 800 микролитров для флуоресценции тиофлавина-Т и 130 микролитров для анализа SEC-MALS, сначала смешивая белок с буфером реакции в 1,5 миллилитровой трубке. Затем добавить гепарин и тиофлавин-Т и хорошо перемешать, трубя вверх и вниз пять раз.
Важно выполнить протокол именно для обеспечения высокой воспроизводимости, смешивания реагентов в том же порядке и выполнения в установленные сроки. Спин образца на 12000 х г и 25 градусов по Цельсию в течение пяти минут, чтобы устранить пузырьки воздуха. После центрифугирования обойтись 200 микролитров образца реакции на колодец в 96-хорошо микроплюе, избегая образования пузырьков воздуха.
Затем запечатайте микропластику, чтобы избежать испарения. Поместите микроплюжь в мультимодный считыватель микропластиров. Выберите полную пластину, или если пластина не заполнена, выберите колодцы для чтения и начните измерение.
Экспорт данных в программное обеспечение для обработки данных. Затем снимите микроплю с оборудования. Затем снимите герметика с микроплюера.
Смешайте агрегированный образец в скважинах, трубя вверх и вниз два раза, и объединить различные репликации в 1,5 миллилитров труб. Смешайте каждый образец тщательно pipetting вверх и вниз пять раз, и обойтись от 10 до 20 микролитров на поверхности слюды для анализа агрегатов атомной микроскопии силы. После этого, урожай агрегатов, вращая каждый 1,5 миллилитров трубки на 20000 х г и 4 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Проанализируйте супернатант SEC-MALS, чтобы подтвердить отсутствие мономерного Тау в образце, что указывает на успешное преобразование в агрегаты. Затем удалите все оставшиеся супернатанты и обозначить 1,5 миллилитровую трубку, содержащую оставшиеся агрегаты с начальной рекомбинантной концентрацией белка Тау и объемом образца. Snap заморозить агрегаты и хранить при 80 градусов по Цельсию.
Для сеяного эксперимента удалите рекомбинантные агрегаты Тау из морозильной камеры, добавьте объем буфера реакции, указанный на этикетке, и позвольте трубке стабилизироваться до комнатной температуры. Затем повторное приостановление агрегатов путем трубопроводов вверх и вниз пять-восемь раз. Sonicate 200 микролитер агрегированный образец на льду с использованием 1 / 8 дюймов microtip в общей сложности в течение 15 секунд с импульсами одной секунды и две секунды с на 30 процентов амплитуды.
Затем приготовьте образец реакции 800 микролитров, сначала смешивая белок с буфером реакции в 1,5 миллилитровой трубке. Затем добавить гепарин и тиофлавин-Т и хорошо перемешать, трубя вверх и вниз пять раз. Спин образцов на 12000 х г и 25 градусов по Цельсию в течение пяти минут, чтобы устранить пузырьки воздуха.
После центрифугации, обойтись 198 микролитров образца реакции на колодец в 96-хорошо микроплюет, избегая образования пузырьков воздуха. Гомогенизировать предварительно сформированный образец фибрала путем трубопроводов вверх и вниз в три раза. Добавить количество, соответствующее желаемому проценту семян к каждой хорошо и перемешать путем трубопроводов вверх и вниз в три раза.
Затем запечатайте микропластику, чтобы избежать испарения. Поместите микроплюжь в мультимодный считыватель микропластиров и начните измерение. После завершения эксперимента снимите микроплю с оборудования.
Затем экспорт данных в электронную таблицу. Рекомбинантный Тау, содержащий мутации C291A и C322A и n терминал его и c терминал c-тегов, очень чист, как визуализировано на странице SDS и практически на 100 процентов мономерный, как оценивается SEC-MALS. Гепарин индуцированной рекомбинантной агрегации Тау последовал тиофлавин-T флуоресценции с использованием возбуждения длины волны 440 нанометров и выброс длины волны 485 нанометров.
Анализ воспроизводим, результаты 10 отдельных скважин практически неразличимы. Рекомбинантные агрегаты Тау являются однородной смесью фибулярные структуры разной длины, похожие на зарегистрированные морфологии ex-vivo. Окончательная смесь реакции не содержит мономера, что предполагает полную конверсию в агрегаты, о чем свидетельствуют измерения SEC-MALS.
Кинетики рекомбинантной агрегации Тау в независимых экспериментальных работает похожи, как подчеркивается аналогичные сигмоидные кривые и неотличимые отставание и фазы роста. Высокий уровень воспроизводимости поддерживается при использовании различных партий белка. Предварительно сформированные рекомбинантные агрегаты Тау эффективны в наборе мономеров Тау и стимулировании формирования агрегатов de novo Tau, а эффективность процесса прямо пропорциональна проценту семян.
Суммы, до 0,0025 процента предварительно сформированных агрегатов Тау, выраженных в объеме, способны обойти рекомбинантное ядро Тау и вызвать де Ново фибральной генерации. Текущий анализ имитирует то, что, как полагают, in vivo неправильного свершения и агрегации Тау и позволяет механистических исследований, которые могли бы пролить свет на процесс патогенеза и представляет собой ценный инструмент для скрининга наркотиков и изучения вмешательства кандидатов наркотиков с различными стадиями процесса. Высокая воспроизводимость анализа позволит ученым реализовать его с относительной легкостью в лаборатории.
Хотя текущий анализ фокусируется только на самой длинной изоформе Тау, человеке Тау-441, приложение может быть адаптировано для изучения различных вариантов Тау. И не забывайте, что выбор правильных реагентов белка и их производство по высоким стандартам качества имеют важное значение для создания надежного и высоко воспроизводимого анализа.
