Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по локализации белка и динамике в фотосинтетических организмах. Объединив метод фотоблейинга с микроскопом супер-разрешения, мы можем обнаружить белковую динамику фотосинтетических организмов в замечательной детали. Этот метод не только дает представление о белковой динамике Прохлорококка.
Он также может быть применен ко многим другим организмам, содержащим радио-re-dop-sing и bacteriochlorophyll. Демонстрацией этой процедуры будет Янсин Лю, аспирант моей лаборатории. Для начала добавьте пять миллилитров морской воды на основе среды Pro99 в культурную колбу и прививайте ее одним миллилитром Prochlorococcus MED4.
Выращиваем прохлорококк при 23 градусах Цельсия при свете с интенсивностью 35 микромоленых фотонов на квадратный метр. Через пять дней соберите один миллилитр культуры в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного формальдегида в трубку, чтобы исправить культуру.
Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, спина вниз образца на 13500 раз G в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно наполните клетки в 100 микролитров среды Pro99.
Храните образец при четырех градусах Цельсия в темноте до готовности к проведению иммуностимулятора. Во-первых, вихрь флакон из полистирола бисера. Используя 50% этанола, приготовьте разбавление от одного до 20 000 в качестве рабочей суспензии.
Включите плиту и установите температуру до 120 градусов по Цельсию. Затем поместите крышки на горячую тарелку. Загрузите 100 микролитров рабочей суспензии на каждую крышку и инкубировать крышки на плите в течение 10 минут.
Затем осторожно перенесите крышки в чашки Петри бисером для хранения при комнатной температуре. Когда готовы покрыть крышки, получить один, убедившись, что это бисером вверх. Добавьте 100 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр раствора поли-L-лизина в центр крышки и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут.
После этого используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать любой непривязанный поли-L-лизин и перенести его в 1,5 миллилитровую трубку. Храните этот поли-L-лизин при четырех градусах цельсия для более длительного использования. Промыть крышку 10 миллилитров ультра фильтрованной воды в 60-миллиметровой чашке Петри, а затем кратко высушить его бумажным полотенцем.
Перенесите крышку с покрытием на новую чашку Петри с Parafilm внизу, которая будет использоваться в качестве окрашивания. Загрузите 100 микролитров фиксированного образца на крышку и дайте ему сидеть в течение 30 минут, чтобы позволить вложение ячейки. Затем используйте бумажное полотенце, чтобы поглотить оставшийся раствор, а затем передать крышку в колодец в 12-хорошо пластины для мытья.
Добавьте один миллилитр буфера PBS к хорошо для мытья крышки. Затем удалите PBS и добавить один миллилитр свежего PBS для мытья крышки во второй раз. Используйте пипетки, чтобы удалить PBS и заменить его на один миллилитр свежеприготовленного буфера протеабилизации.
Инкубировать мытье посуды при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем удалите буфер пермеабилизации. Начните процесс стирки, добавив один миллилитр свежего буфера PBS.
Поместите мытье посуды на шейкер, чтобы аккуратно агитировать блюдо в течение пяти минут. После этого удалите PBS и повторите процесс стирки три раза. Перенесите промытую крышку на окрашивание блюда.
Добавьте 50 микролитров блокирующего буфера в верхней части крышки. Поместите все окрашивание блюдо на лед, а затем переместить его под ксенон источник света для фотоотливания, по крайней мере 60 минут. После фотоблейинга и блокировки используйте край бумажного полотенца для удаления блокирующего буфера.
Во-первых, разбавить один микролитер анти-Fts' антитела в 99 микролитров блокирующего буфера. Поместите 50 микролитров разбавленного первичного антитела на крышку и инкубировать его при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку в колодец стиральной тарелки.
Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Затем перенесите мытье посуды в шейкер и аккуратно встряхните его в течение пяти минут. Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза.
Затем перенесите крышку на окрашивание блюда. Поместите 50 микролитров разбавленного вторичного антитела на крышку и инкубировать его в темноте и при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку обратно в стиральную тарелку.
Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Оберните стиральную тарелку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света. Перенесите тарелку в шейкер и аккуратно встряхните ее в течение пяти минут.
Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза. Непосредственно перед изображением STORM подготовьтесь к одному миллилитру буфера изображений, как указано в текстовом протоколе. Загрузите крышку в погрузочную камеру.
Добавьте свежеприготовленный буфер изображения, будучи нежным, чтобы избежать смывания цианобактериальных клеток. После этого поместите прямоугольный крышку поверх буфера изображения, чтобы предотвратить его реакцию с кислородом в воздухе. Включите камеру, светодиодный свет и лазер и откройте программное обеспечение STORM.
Добавить пол капли масла погружения на верхней части объектива. Загрузите камеру, убедившись, что объектив цели соего контакта с крышкой. И изучите сигнал с помощью 750-нанометрового лазера.
Определите область выборки, которая содержит как клетки, так и фидуциальные маркеры. Затем запустите программное обеспечение для коррекции проб дрейфа. Приобрети одно широкое изображение в качестве эталона, с увеличением умножения электронов камеры на 300 и временем экспозиции 30 миллисекунд.
Увеличьте интенсивность лазера возбудивания 750 нанометров примерно до 4,5 киловатт на квадратный сантиметр. После того, как флюорофоры перешли в разреженный мигающий узор, приобрети одно изображение супер-разрешения, собрав 10 000 кадров на 33 герц. Затем реконструируют изображения супер-разрешения из необработанных данных, изложенных в текстовом протоколе.
В этом исследовании, STORM используется для достижения супер-разрешение изображения путем активации отдельных фото-переключаемых фторфоров стохастично. Расположение каждого фторфора записывается, и изображение с супер-разрешением затем строится на основе этих мест. В то время как спектры поглощения Prochlorococcus достигает 447 и 680 нанометров и имеет минимальное поглощение выше 700 нанометров, клетки Prochlorococcus MED4 по-прежнему излучают высокую аутофторесценцию при воздействии чрезвычайно высокой интенсивности 750-нанометрового лазера, который необходим для визуализации STORM.
После использования метода фотоотливания, описанного здесь в течение 30 минут, наблюдается снижение аутофторесценции клеток, хотя несколько клеток с аутофторесценцией все еще обнаружены. Удлинение фотооттеки до 60 минут приводит к потере большинством клеток аутофторесценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод фотоблейинга способен значительно снизить аутофторесценцию фотосинтетических организмов.
После фотоблейинга, STORM используется для визуализации белка деления клеток, Fts, в клетках. С помощью STORM раскрывается подробная морфология кольца Фтса. Путем вращать изображения 3D STORM, 4 по-разному типа морфологий были определены, кластеры, неполное кольцо, вполне кольцо, и двойные кольца.
Важно помнить, что интенсивность света и продолжительность фотоблейча могут отличаться для разных организмов. После своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователей, которые хотят изучить организацию белка и потенциальную функцию в фотосинтетических клетках в деталях.
