Этот конфокальный микроскопический протокол позволит интерпретировать экологическое поведение и адаптацию микроводорослей из экстремальных сред с медленным ростом в лаборатории с использованием автофлуоресценции их пигментов. Этот метод не является инвазивным и сводит к минимуму артефакты, поскольку химические соединения не используются. Знание характеристик пигментов автотрофов и соответствующего роста позволит разработать методы контроля, представляющие наибольший интерес для туристических пещер и архитектурных памятников.
Начните приготовление инокулята Chroothece mobilis с переноса его из агаровой культуры в среду морской воды или жидкую среду SWES. Поддерживайте все культуры в течение двух недель с периодом от 16 до 8 светлых темных фотографий при 20 градусах Цельсия при низкой интенсивности белого света и без встряхивания до получения желаемой плотности клеток. Используйте один миллилитр экспоненциальной фазовой культуры, имеющей пять умноженных на 10 или треть клеток на миллилитр плотности клеток, для инокуляции в 24-луночную пластину для различных экспериментов.
Чтобы воспроизвести монохроматический световой эффект, используйте зеленый фильтр, позволяющий зеленому свету проходить от 470 до 570 нанометров с пиком на длине волны 506 нанометров и красному свету, регулируемому с помощью фильтра от 590 до 720 нанометров и пикам на 678 нанометрах. Подвергайте клеточные культуры воздействию этого света в течение двух недель. Включите все компоненты инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа, включая лазер.
Установите ячейки в питательной среде SWES из каждой экспериментальной лунки 24-луночной пластины в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю чашку для визуализации. Выберите 63-кратную или 1,30-кратную цифровую апертуру или иммерсионный объектив NA с глицерином и поместите глицерин поверх объектива. Затем поместите луночную пластину на столик микроскопа, чтобы образец не двигался во время получения изображения.
Отцентрируйте образец по световому пути и сфокусируйтесь на центре клетки, выбрав плоскость с наибольшей интенсивностью флуоресценции. После этого откройте программное обеспечение для получения изображений и выберите XY lambda из выпадающего списка в режиме съемки. Выберите линию возбуждения лазера 561 нанометр, восемь бит динамического диапазона и 1024 на 1024 пикселя.
Соберите спектры флуоресцентного излучения в полосе пропускания 10 нанометров и размер шага лямбда в четыре нанометра в диапазоне от 570 до 760 нанометров. Установите точечное отверстие на одном воздушном блоке и запустите лямбда-сканирование. Повторив этот процесс в разных полях зрения и в разных условиях красного и зеленого света, сохраните все данные.
После получения лямбда-сканирования нажмите на окно количественной оценки в верхней части программного обеспечения, чтобы оценить собранные спектры флуоресцентного излучения. Перейдите в открытое окно проекта и выберите один лямбда-файл XY. Выберите анализ многослойного профиля в программном обеспечении для обработки изображений и определите интересующую область площадью четыре микрометра в центре ячейки для анализа средней интенсивности флуоресценции.
Экспортируйте данные и CSV, прежде чем повторять процесс с разными ячейками в разных условиях. Затем откройте файлы CSV, чтобы выбрать различные пики излучения флуоресценции во всех измеряемых областях, представляющих интерес, выбрав максимальные данные флуоресценции фикоэритрина, фикоцианобилина, C.фикоцианина, аллофикоцианина и хлорофилла А соответственно в файле CSV. После этого создайте новую таблицу со всеми максимальными значениями флуоресценции, полученными от каждого пика фикобилипротеина и хлорофилла, и нанесите данные на график.
Наблюдались значимые различия в средней интенсивности флуоресценции. Средняя интенсивность флуоресценции фикоэритрина фикоцианобилина значительно снижалась, когда клетки подвергались воздействию монохроматического зеленого света. Напротив, никакой разницы в красном свете не наблюдалось по сравнению с контролем.
Зеленый свет оказывал противоположное влияние на аллофикоцианин и хлорофилл А, при этом средняя интенсивность флуоресценции значительно увеличивалась из-за адаптации антенных комплексов из-за увеличения количества или улучшения связности антенных комплексов, среди прочего. Красный свет вызвал незначительное увеличение флуоресценции аллофикоцианина и хлорофилла. Чтобы изучить влияние различных условий роста на клетки в культуре, крайне важно выполнять измерения с одинаковыми настройками микроскопа.
Можно проанализировать другие параметры окружающей среды, относящиеся к культуре автофлуоресцентных организмов, а также сигнал флуоресценции в видимом спектре. Этот метод является очень мощным подходом к изучению живых организмов с несколькими автофлуоресцентными пигментами.
