Этот метод имеет важное значение, поскольку он может быть использован для получения большого количества полностью дифференцированных остеокластов in vitro. Основным преимуществом этого метода является то, что он является более стабильным и безопасным и изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционным производством. Этот метод может обеспечить стабильный источник остеокластов, которые являются важным объектом метаболических заболеваний костей, включая остеопороз, пародонтит и перипротетический остеолиз.
С незначительными изменениями, этот протокол также может быть подходящим для получения различных видов костного мозга, полученных клеток у крыс или других животных. Для начала поместите усыпляемых животных на дезинфицированную доску в положении лежа. Используя стерильные ножницы, сделать разрез примерно один сантиметр в длину на проксимальной бедренной кости, чтобы очистить кожу.
Далее, вскрыть бедренной кости и голени. Тщательно и осторожно, сократить двусторонние части соединения вокруг бедра, колена и голеностопного сустава, чтобы изолировать голени и бедренной кости. Отрежьте часть тканей вокруг кости, убедившись, что быть тщательным.
Затем поместите очищенные кости в блюдо с пятью миллилитров полной культуры среды. Используйте стерильные ножницы, чтобы отрезать длинную кость. Используйте одну миллилитровую шприц-иглу, чтобы тщательно промыть полость костного мозга 10 миллилитров полных средств массовой информации до тех пор, пока полость костного мозга не станет белой.
Перенесите эту клеточную подвеску в 50-миллилитровую трубку и процедите ее с помощью 70-метрового ситечко, чтобы удалить оставшуюся ткань. Добавьте пять миллилитров буфера красного лиза крови и инкубировать клетки на льду в течение восьми минут. После этого центрифуга клетки в 250 раз G в течение пяти минут, чтобы дать ячейки гранулы.
Аспирировать супернатант и повторное течение клеток в 10 миллилитров полного средства массовой информации. Используйте гемоцитометр для подсчета ячеек и расчета времени, затраченного на действия, предпринятые для этого метода. Во-первых, поместите усыпляемых животных на дезинфицированную доску в положении лежа.
Используя стерильные ножницы, сделать разрез примерно один сантиметр в длину на проксимальной бедренной кости, чтобы очистить кожу. Далее, вскрыть бедренной кости и голени. Отрежьте части тканей вокруг кости, хотя нет необходимости удалять ткани полностью.
Промыть голени и бедренной кости с 12 миллилитров PBS, а затем разрезать их пополам. Поместите snipped голени и бедренной кости в подготовленный один миллилитр пипетки кончик, и поместите это в подготовленную трубку микро центрифуги. Центрифуга трубки три раза при 1000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 45 секунд.
После этого удалите кончик пипетки, содержащий кость, из трубки, оставив костный мозг в трубке. Добавить 200 микролитров PBS в трубку, и пипетки вверх и вниз неоднократно распадаются костного мозга тщательно. Перенесите эту клеточную подвеску в 50-миллилитровую трубку и отфильтрув ее 70-микрометровым ситечком, чтобы удалить оставшиеся ткани.
Затем используйте гемоцитометр для подсчета ячеек и расчета времени, затраченных на шаги, предпринятые в этом разделе. Добавьте шесть миллилитров раствора разделения клеток в стерильную силико-центробежную трубку. Добавьте разбавленную клеточную суспензию в трубку.
После добавления подвески между слоем ячеек и раствором разделения появится четкий предел. Затем прилипать кончик пипетки к внутренней поверхности трубки под углом 45 градусов. Центрифуга слоистых раствора в горизонтальной центрифуге при 500 раз G в течение 30 минут.
После этого, аспирировать облачно второй слой, который содержит целевые клетки сверху вниз. Перенесите клетки-мишени в новую трубку. Добавить пять миллилитров PBS для мытья клеток, и центрифуга на 250 раз G в течение пяти минут.
Повторите этот процесс стирки, добавив PBS и центрифугирования в общей сложности три моет. Повторное высасывка клеточных гранул со средой индукции костного мозга. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
Затем добавьте пять-восемь миллилитров индукционной среды костного мозга, чтобы получить окончательный раствор клеток в 300 000 клеток на миллилитр. Добавьте один миллилитр этого клеточного раствора к каждому колодец из 24 хорошо пластины. После инкубации клеток при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов, осторожно аспирировать от среды и добавить один миллилитр индукции остеокласта среды для каждой хорошо.
Аккуратно агитировать пластину и вернуть ее в инкубатор. Каждые 48 часов, удалить и заменить 0,8 миллилитров индуцции остеокласта среды из каждой хорошо. Агитировать пластину осторожно, прежде чем вернуть его в инкубатор.
Чтобы начать предварительное лечение костных ломтиков, используйте микроэлектровую пилу, чтобы разрезать свежую бедренную кору бедренной кости на два сантиметра толщиной ломтиками вдоль продольной оси. После резки и измельчения ломтиков, мыть ломтики, погружая их в стакан деионизированной воды и подвергая их ультразвуку на 100 герц в течение одного часа. Повторите этот процесс стирки три раза.
Погрузите вымытые ломтики в 75%-ный алкоголь в течение двух часов. Затем, аспирировать от алкоголя и подвергать каждый слайд ломтиков ультрафиолетового света в течение одного часа на чистой платформе. Чтобы начать toluidine голубое окрашивание, поместите предварительно обработанные кости ломтиками в колодцы 24 хорошо пластины.
После этого добавьте культурную среду в 24 хорошо пластины, чтобы погрузить кости ломтиками в течение двух часов. Завод и вызвать клетки, как поопродемонстрировано ранее. После остеокластов появились в четыре-шесть дней, мыть ломтики с одним миллилитр 0,25 молярного гидроксида аммония.
Sonicate ломтики три раза в течение пяти минут каждый, чтобы удалить живые клетки и для анализа ямы ресорбции на кости ломтиками. Затем удалите гидроксид аммония и испачкайте ломтики одним миллилитром 1%толуидинового синего раствора на ломтик в течение двух минут. Вымойте пятна ломтиками с PBS.
Случайным образом выберите пять представлений и используйте программное обеспечение для анализа изображений для выполнения полуколиченого анализа области ресорбции. Во-первых, префикс кости ломтиками с одним миллилитром 2,5%glutaraldehyde на ломтик в течение двух часов при комнатной температуре. Sonicate префиксированные ломтики три раза в течение трех минут каждый с одним молярным гидроксидом аммония, чтобы удалить клетки.
Затем удалите гидроксид аммония и трижды промыть ломтики костей с помощью PBS, при этом каждая стирка длится 12 минут. Исправить промывают кости ломтиками с 1%osmic кислоты в течение двух часов при комнатной температуре. Выполните обезвоживание градиента этанола, как указано в текстовом протоколе.
После этого замените этанол изоамил ацетат на 15 минут. Пальто ломтики с золотым палладием и анализировать их путем сканирования электронной микроскопии. В этом исследовании, большое количество прекурсоров остеокласта были изолированы, очищены и успешно индуцированных стать остеокластов.
Дополняя M-CSF и RANKL, гигантские остеокласты рассматриваются в дни пять-шесть. Формирование этих остеокластов успешно идентифицируется путем окрашивания ловушек. Большие и фиолетовые клетки считаются положительными клетками TRAP с несколькими ядрами.
С помощью этого метода, это типично для получения 800 остеокластов, содержащих до 30 ядер на остеокласта в 24 хорошо пластины. По сравнению с традиционным методом, этот улучшенный метод экономит около 20 минут в течение всего процесса изоляции. Использование костных ломтиков для оценки активности костной ресорбции является типичным методом in vitro.
Через толуйдин синий окрашивания, область резорбции визуализирована как светло-зеленый. Структуру и характеристики костных ям можно четко наблюдать путем сканирования электронной микроскопии. CTR, один из остеокластов конкретных маркеров клеток, имеет решающее значение для выявления остеокластов и изучения формирования остеокластов в кости.
Положительное выражение CTR четко определяет остеокласты и отличает их от макрофагов поликарионов. CTR четко указывается в иммунофлуоресценции анализы зеленого цвета, в то время как синий указывает на ядра клеток. Убедитесь в том, чтобы не перелом бедренной кости и голени, чтобы избежать потери костного мозга.
Человек, который никогда не выполнял этот метод раньше, может бороться при оказании помощи клеткам решение операции. Наконечник пипетки должен быть прилип к внутренней поверхности трубки и храниться под углом 45 градусов к внутренней поверхности.
