Успешное применение этих методов позволит продать кинетическую оценку фармакологических испытаний или прохождение ксенобиотических загрязняющих веществ через морфологически нетронутую плаценту. Метод перфузии плаценты грызунов позволяет получить более высокую пропускную способность фармакологических или токсикологических исследований, так как несколько соединений могут быть оценены с помощью ткани одной плотины. Демонстрацией техники будет Джанин Д'Эррико, старший аспирант из моей лаборатории.
Перед началом процедуры аккуратно заполните все камеры, иглы, стеклянные микропипеты, трубки и резервуары с разогретой физиологической солью раствором или PSS, тщательно удаляя любые пузырьки воздуха с тонкой наконечником передачи пипетки по мере необходимости. Включите все три способа stopcocks в выключенном положении, чтобы обеспечить жидкость в пипетки. Поместите один галстук на каждый из двух стеклянных микропипетов, подготовленных для маточной канюлиции, и на две тупые иглы, предназначенные для пупочной канюли.
Затем закретуть связи, чтобы предотвратить потерю во время движения камеры. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку носа в анестезированной гестационный день 20 самки беременной крысы, поднимите один рог матки из живота и распространение рога вдоль, внешние животному. Используйте плетеные шелковые швы, чтобы связать маточной артерии на вагинальных и яичников концы рога, в том числе яичников внутри шва с рога матки.
Используя хирургические ножницы, сделать разрезы на проксимальной стороне яичников галстук и дистальной стороне вагинального галстука. Перенесите рог матки в рассеченное блюдо, облицованное силиконовой резиной и наполненное холодной PSS. С яичников стороны влево и вагинальной стороне справа, осторожно нажмите рассечение булавку через маточные рога в силиконовой резины для стабилизации матки.
Выберите материнскую плаценту плода единицы центральной к рога. Используя тонкие типсы и ножницы, удалите амниотической мембраны с поверхности плода плаценты, заботясь, чтобы избежать пуповины. Разгадать и ligate пуповины, чтобы отделить плода щенка.
После выявления пупочной артерии и вены, осторожно отделить и ligate пупочной сосудов. Затем вырезать пуповинной вены небольшой короче, чем пуповинной артерии для удобства идентификации. И ligate маточной артерии и вены с хирургическими ножницами.
Поддерживая правильную ориентацию анатомического кровотока маточных артерий, поместите плацентарный блок в модифицированную изолированную камеру сосуда, наполненную теплой кислородом PSS под рассеченным микроскопом. Используя одну пару тонких типсов в каждой руке, можно привить проксимальные и дистальные концы маточной артерии на стеклянные микропипюты. Плотно защитите артерию с ранее помещенным стерильным нейлоновым швом.
Cannulate и обеспечить пуповинной артерии на 23 калибровочных тупой иглой. Затем cannulate и обеспечить пуповинной вены на 25 калибровочных тупой иглы и backfill все стоп-cocks и трубки для предотвращения пузырьков воздуха. Не забудьте проверить все стоп-cocks, канюли, и трубки для пузырьков воздуха, как воздушный болюс в системе приведет к клеточной бедствия и устранить встречный ток потока в плаценте.
Соедините все трубки в соответствии с рисунком. Поместите небольшие весовые лодки под дистальную канюляцию материнской маточной артерии и под игольчатую канюляцию пупочной вены плода, чтобы поймать сточные воды, которые появятся в ходе процедуры. Подготовь коллекционую пластину для сточных вод для более длительного анализа.
Откройте стопкок, чтобы позволить жидкости течь через трубы к плаценте и включите перистальтический насос, контроль давления и монитор давления. Медленно увеличьте давление до 80 миллиметров ртутного столба, считыв на мониторе давления. Медленно откройте стопкок, чтобы позволить поток жидкости в маточную артерию.
Пополнить все резервуары для поддержания объема жидкости на протяжении всего эксперимента. После того, как ткани имеют equilibrated в течение 30 минут, чтобы васкулатура приспособиться к новому потоку жидкости, установить базовый перфузии путем сбора сточных вод в течение 10 минут от обоих весовых лодок. Измерьте объем жидкости, которая появляется через маточную артерию и пуповину.
В конце базового периода сбора ввести экспериментальное лечение в маточную артерию. Затем собирайте образцы из дистальной артерии матки и сточных вод пупочных вен плода каждые 10 минут в общей сложности 180 минут после инфузии. Измерьте загрязняющие вещества в образцах жидкости.
Перфузия с синим красителем Эванса для проверки системы и визуализации соответствующей функции жидкости и плацентарный барьер для предотвращения переноса загрязняющих веществ в отсек плода показывает, что краситель достиг и проникся плацентарный ткани в этой системе. При более тщательном расследовании становится ясно, что синий краситель Эванса не вошел в пуповиную вену плода, что, как ожидается, так как синий краситель Эванса обязан альбумин. В этом репрезентативном эксперименте была выявлена уменьшенная передача жидкости в отделение плода в течение 10 минут после инфузии полистирола.
Передача полистирола в отделение плода достигла пика в 20 минут и продолжалась в течение 90 минут. Самое главное помнить во время канкуляции, чтобы идти медленно. Пипетки и ткани очень деликатны и могут легко стать сломанной или разорванной.
Взвешивая effluence, эта методология может быть использована для исследования плацентарской физиологии, а также транслокации материала.
