Gap соединения были предложены в качестве целей наркотиков. Анализ Iodide-YFP-GJIC совместим с высокой пропускной способностью скрининга, чтобы обнаружить разрыв соединения модуляторов. Он используется для проверки воздействия большого числа соединений на деятельность соединения зазоров в относительно короткий период времени.
Анализ Iodide-YFP-GJIC прост, надежн, повторяем и недорог. Для этого анализа требуются только донорские и донорские клетки и два сбалансированных солевых раствора. Никаких дополнительных реагентов, таких как Люцифер желтый и Calcein AM не требуется.
Кроме того, он измеряет общий разрыв соединения деятельности клеток в одной хорошо, что приводит к низкой между хорошо изменчивости. Для начала этой процедуры вырастет LN215 ячеек до 80% стечения в дополненной DMEM, как указано в текстовом протоколе. За день до трансдукции мыть клетки дважды с 10 миллилитров PBS.
Добавить два миллилитров 0,25%трипсина EDTA в клетки и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. С помощью 10-миллилитрового серологического пипетки повторно помесят клетки в пять миллилитров среды культуры и отрегулируйте плотность клеток до 50 000 клеток на миллилитр. Добавьте 400 микролитров мультимедиа, которые содержат 20 000 ячеек к каждому колодец 24-колодец культуры пластины.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день вывести две скважины, заменив культурную среду 400 микролитров смеси лентивируса и свежей культуры, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр. Ибо отсутствие контроля над вирусом заменяет культурную среду свежей культурной средой, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 часов. Затем аспирировать среды, содержащие лентивирусы, и свежие среды культуры. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение еще 72 часов.
После этого, мыть клетки в каждом хорошо в два раза с 0,5 миллилитров PBS. Добавить 300 микролитров 0,25%трипсина EDTA в клетки, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторное течение клеток в двух миллилитров культуры среды, а затем пластины их в шесть хорошо культуры пластин с двумя микрограммами на миллилитр пуромицина.
Культура клетки, пока все клетки в контрольных скважин мертвы, что обычно занимает около недели. Во-первых, отдельно культуры LN215-YFP и LN215-йодидных клеток в 100-миллиметровых пластин в среде культуры для достижения населения, необходимого для анализа. За день до анализа, мыть каждую тарелку с 10 миллилитров PBS.
Лечить каждую тарелку с двумя миллилитров 0,25%трипсина EDTA раствор, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Повторное использование клеток в четырех миллилитров среды культуры и передать их в 15-миллилитровых конических труб. Центрифуга при 1000 г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовещение каждой клеточной гранулы в пять миллилитров среды культуры. Pipette вверх и вниз около 20 раз, чтобы разбить любые ячейки сгустки. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
А затем разбавить клетки в среде культуры, чтобы сделать подвес клеток на плотности показано здесь. Затем смешайте семь миллилитров каждой клеточной подвески вместе в резервуаре. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров этой смеси к каждому колодец 96-ну культуры пластины.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 24 часов. Во-первых, используйте флуоресцентный микроскоп с увеличением 20X и фильтр GFP, чтобы проверить 96-хорошо пластин, чтобы убедиться, что Есть нет скопления клеток, и что культуры полностью confluent и хорошо распределены. По крайней мере за 30 минут до анализа включите микроплюрат и установите его до 37 градусов по Цельсию.
Вымойте трубки автоматизированного инжектора с тремя миллилитров 70% этанола, три миллилитров дистиллированной воды, и три миллилитров I-решения. Далее, тепло C и I-решений до 37 градусов по Цельсию в водяной бане. Либо аспирировать рост среды или инвертировать пластины, чтобы очистить его.
Нажмите на любую остаточную среду. Затем добавьте C-решение в резервуар с помощью многоканальной пипетки, чтобы добавить 200 микролитров C-решения к каждой пластине. Либо аспирировать раствор или инвертировать пластину, чтобы очистить его, что делает выстучать любой остаточный раствор.
Добавьте 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Затем добавьте один микролитр либо 2,5-миллимолярный химический запас или DMSO в качестве транспортного средства, и добавьте еще 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в воздухе в течение примерно 10 минут.
Во время инкубации начните устанавливать параметры в программе чтения микроплатформ, нажав кнопку Протоколы управления. Нажмите на новую кнопку. Выберите интенсивность флуоресценции в разделе Метод измерения и режим Well Mode в разделе Режим чтения.
Далее нажмите кнопку OK. Появится новая вкладка. В меню «Основные параметры» длина волны Возбуждения составляет 485 нанометров, а эмиссия — до 520 нанометров.
Выберите нижнюю оптику для чтения флуоресценции снизу. Затем установите время начала измерения на ноль секунд, количество интервалов будет 25, количество вспышек на колодец и интервал будет 20, а интервал времени будет 0,4 секунды. В меню Layout нарисуйте область пластины для чтения.
В меню Концентрации/Объемы/Shacking установлен считыватель микропластиров для впрыскивания 100 микролитров I-решения к каждому хорошо со скоростью впрыска 135 микролитров в секунду. В меню Время инъекций установите время начала инъекции на одну секунду. Затем нажмите кнопку «Начало измерения».
Когда инкубация завершена, перенесите пластины 96-колодец на считыватель микропластиц и начните измерение, нажав кнопку измерения Пуск снова. В этом исследовании, йод-желтый флуоресцентный белок-пробел соединения межклеточной связи анализ используется с LN215-YFP и LN215-йодных клеток для экрана 2, 320 химических веществ для выявления новых разрывов внутриклеточных модуляторов связи. Homosalate, как видно, подавляет 50% разрыва внутриклеточной связи.
В то время как тербинафин полностью подавляет его. Это подтверждает тербинафин в качестве ингибитора разрыва соединения. Этот анализ измеряет GJIC между соседними донорами и клетками-приемокторами, поэтому донорские и приемочные клетки должны быть полностью разобщены перед покрытием.
И слияние смешанной культуры должно быть 100%, чтобы максимизировать образование разрывов между клетками. Данные о курсах времени, отношения реакции дозы и оценка обратимости модуляторов соединения разрыва могут быть получены с помощью анализа Iodide-YFP-GJIC. Кроме того, Iodide-YFP конкретных connexin GJIC анализы могут быть созданы путем индуцирования выражения коннексина интереса в ячейки, лишенные функциональных соединений разрыв.
Это позволяет определить значение IC50 химического вещества определенного типа коннексина. Анализ Iodide-YFP-GJIC может быть использован для скрининга с высокой пропускной способностью, поскольку он является надежным, повторяемым и недорогим. Этот анализ помогает найти разрыв соединения модуляции химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологической оценки.
