Гетерологичная экспрессия коннексинов и иннексинов в ооцитах Xenopus является мощным подходом к анализу биофизических свойств щелевых соединений. Основным преимуществом нашей техники является использование подхода к измерению тока с высокой стороны, который подходит для зажимов с двойным напряжением. Процедура будет продемонстрирована Юань Шуй, постдокторантом из моей лаборатории.
Как только от 70 до 80% ооцитов дефоликулируют, декантируйте раствор фермента, осторожно наклоняя трубку. Промыть ооциты пять раз, заполнив пробирку раствором ND96, а затем декантируя раствор. После окончательной промывки переложите ооциты в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую раствор ND96.
Используйте чистую стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать и перенести большие, здоровые на вид ооциты в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую раствор ND96, дополненный пируватом натрия и пенициллином стрептомицином. Приготовьте чашку для инъекций ооцитов, приклеив небольшой кусочек нейлоновой сетки на дно 35-миллиметровой чашки Петри. Наполните чашку для инъекций ооцитов примерно наполовину раствором ND96, дополненным пируватом и пенициллином стрептомицином.
Затем поместите от 25 до 30 ооцитов рядами внутрь чашки Петри. Обратно наполните инъекционную микропипетку легким минеральным маслом и вставьте ее в держатель микропипетки инжектора. Перенос цРНК с одной из хранящихся аликвот на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри или дно путем пипетирования.
Нажмите кнопку заполнения в контроллере инжектора, чтобы аспирировать каплю кРНК в кончике микропипетки. Затем нажмите кнопку инъекции, чтобы ввести цРНК. Переведите введенные ооциты в новую чашку Петри, содержащую раствор ND96, дополненный пируватом и пенициллином стрептомицином.
Храните их внутри экологической камеры при температуре от 15 до 18 градусов по Цельсию в течение одного-трех дней. Заменяйте раствор ежедневно, перенося ооциты в новую чашку Петри. Используйте два тонких пинцета, чтобы аккуратно отклеить прозрачную мембрану виллина, которая обертывает яйцеклетку.
Затем поместите два ооцита на лунку в камеру для спаривания ооцитов, содержащую раствор ND96. Подключите датчик дифференциального напряжения и токопроводящие кабели к ячейке модели. Затем подключите красную и черную розетки к дифференциальному датчику напряжения с помощью прилагаемой перемычки и подключите любую ножку перемычки к любому контакту в ячейке модели.
Подключите провод заземления в ячейке модели к кабелю от гнезда заземляющей цепи усилителя. Поверните ручки смещения VM и VE, чтобы свести к нулю мембранные измерители напряжения и мембранного тока. Переключите зажим с выключенного на быстрый или медленный и поверните коэффициент усиления по часовой стрелке до уровня, который позволяет правильному зажиму напряжения обнулить напряжение электродных и ванных электродных метров усилителя.
Запустите простой протокол сбора, содержащий несколько шагов напряжения, чтобы убедиться, что напряжение, отображаемое в мембранном измерителе напряжения, изменяется в соответствии с протоколом сбора и что следы напряжения и тока правильно отображаются в Clampex. Поместите чашку Петри, содержащую парные ооциты, в емкость чашки Петри записывающей платформы. Выберите пару ооцитов и при необходимости поверните чашку Петри так, чтобы два ооцита находились в левом и правом направлении.
Зафиксируйте сцену в нужном положении с помощью магнитного основания. Поместите опорный электрод рядом с краем чашки Петри со стороны пользователя. Затем подключите электрод опорного напряжения к черной розетке только в одном из двух датчиков дифференциального напряжения.
Возьмите пару стеклянных микропипет, отломите немного наконечника алмазным писцом и сгладьте край наконечника огневой полировкой. Держите микропипетку над пламенем спиртовой горелки и согните ее под углом плавного угла на расстоянии примерно одного сантиметра от наконечника. Обратно заполните стеклянную пипетку полностью раствором ND96, а затем вставьте ее в предварительно заполненный держатель микроэлектрода.
Убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха. Вставьте двухмиллиметровый штифт держателя микроэлектрода в двухмиллиметровую розетку провода подключения электрода дифференциального напряжения. Зажмите двухмиллиметровое гнездо на магнитном зажиме и направьте наконечник электрода дифференциального напряжения на один из двух ооцитов.
Вставьте одномиллиметровый контакт соединительного провода электрода дифференциального напряжения в красную розетку датчика дифференциального напряжения с той же стороны. Подготовьте электроды напряжения и тока из стеклянных капилляров и обратно заполните их раствором хлористого калия. Затем вставьте электроды в держатели электродов, поставляемые с усилителями.
Опустите электроды в раствор ванны и поверните циферблаты смещения VM и VE offset, чтобы свести к нулю мембранные измерители напряжения и мембранного тока. Проверьте сопротивление электрода, нажав VM electrode test и VE electrode test. Вставьте электроды тока и напряжения в яйцеклетки и наблюдайте за отрицательными мембранными потенциалами.
Далее, в зажимной секции усилителя, убедитесь, что коэффициент усиления постоянного тока находится в положении. Поверните ручку усиления по часовой стрелке до уровня, который позволяет правильно зажать напряжение, и переключите переключатель зажима с выключенного на быстрый. Наконец, запустите протокол сбора.
Здесь показана схема эксперимента с ооцитами. Отрицательные и положительные ступени напряжения мембраны применяются к яйцеклетке 1 от удерживающего мембранного напряжения минус 30 милливольт, тогда как ооцит 2 удерживается при постоянном мембранном напряжении минус 30 милливольт. Транспереходное напряжение, или Vj, определяется как мембранное напряжение ооцита 2 минус мембранное напряжение ооцита 1.
Репрезентативные изображения показывают следы Lj образца и результирующую нормализованную переходную проводимость транспереходного напряжения UNC-9 гомотипических зазорных переходов. Образцы следов Lj и результирующее нормализованное отношение Gj-Vj гомотипических зазоров UNC-7b показаны здесь. Результаты показывают, что эти два типа Gj отличаются Vj-зависимой скоростью инактивации Ij, зависимостью Vj и количеством остаточного Gj.При попытке процедуры очень важно убедиться, что система электродов дифференциального напряжения не имеет пузырьков воздуха, а ее наконечник направлен очень близко к ооциту, а электроды напряжения и тока имеют сопротивление примерно в одну микроом.
Наша методика проста в реализации. Это может представлять особый интерес для тех лабораторий, которые недавно заинтересовались использованием ооцитов Xenopus для изучения щелевых соединений.
