Этот протокол имеет важное значение, поскольку он описывает метод, который может быть использован для разделения нескольких флуоресцентных сигналов в одном образце. По сравнению с традиционными методами, возбуждение-сканирование может увеличить скорость эксперимента и повысить чувствительность данных. Используя различные источники освещения, такие как суперконтинумный лазер, этот метод может быть применим к спиннинг диска или лазерного сканирования конфокальных систем микроскопа.
При выполнении возбудителя-сканирования, спектральной микроскопии изображений, важно проверить, что пик возбуждения каждой флуоресцентной метки происходит на разной длине волны. Для начала наймите перевернутый флуоресцентный микроскоп и камеру, как описано в текстовом протоколе. Затем загрузите образец на сцену.
Из выпадают меню микроменеджер главного окна, выберите 475 нанометров для первоначального просмотра образца. Затем дважды нажмите на поле рядом с экспозицией и введите 100, чтобы установить время экспозиции на 100 миллисекунд. Наконец, нажмите в прямом эфире, чтобы просмотреть образец.
Теперь нажмите на Auto. Кнопка автоматического диапазона интенсивности, чтобы принести минимальные и максимальные значения в значимые, визуальные диапазоны. Затем используйте ручки фокусировки микроскопа, чтобы сфокусировать образец.
Оказавшись в фокусе, отрегулируйте положение образца так, чтобы его край был в центре поля зрения. Затем отладить фокус. Образец находится в фокусе, когда края объектов на изображении появляются острые.
Теперь откройте многомерный инструмент приобретения. В меню нажмите кнопку нагрузки и выберите заданную настройку, содержащую соответствующий диапазон длин волн для спектрального приобретения. Как только параметры приобретения подтвердятся, переместите в пустую область образца и нажмите кнопку acquire, чтобы собрать спектральный стек изображений, содержащий фон и шум, чтобы использовать для вычитания позже.
Затем перемести образец, чтобы найти самые яркие регионы. Образцы, вероятно, имеют более интенсивный флуоресценции от края образца. После того, как самая яркая область находится, возьмите один стек изображений.
Загрузите приобретенное изображение в Image J и используйте функцию измерения Image J, чтобы подтвердить, что ни одна длина волн не содержит переэкспонированных пикселей. Если из-за передержки требуется сокращенное время экспозиции, фоновое изображение также должно быть отбито с новым временем экспозиции. Если было установлено, что какое-либо из изображений содержит восходящий предел обнаружения камеры, отрегулируйте время экспозиции спектрального сканирования, чтобы гарантировать, что максимальный сигнал по всему спектральному диапазону не превышает динамический диапазон камеры.
С соответствующим временем экспозиции в настоящее время определяется, место необряхаемый образец на сцену. Приобретайте данные спектрального изображения из неоявного образца, чтобы определить, существует ли какая-либо основная аутофторенсия. Затем поместите на сцену одно помеченный образец.
Приобретайте данные спектральных изображений из каждого из одно помеченных образцов для использования в качестве спектрального управления для создания спектральной библиотеки. Выполните сканирование для каждого образца управления с использованием одинакового времени экспозиции диапазона длин волн и настроек камеры. Затем поместите слайд, содержащий экспериментальный образец, на микроскоп.
Выберите поле зрения, которое имеет соответствующие помеченные ячейки, и приобретете данные спектрального изображения из выборки с помощью определенных параметров приобретения. Исправьте изображения к плоской спектральной реакции, вычитая фоновый спектр из изображения образца и умножая изображение на коэффициент коррекции. Здесь для быстрой обработки изображений используется скрипт MATLAB.
Затем создать спектральную библиотеку. Для получения наилучших результатов нормализуете каждый конечный участник диапазона длин волн наибольшей интенсивности, определяя, какая длина волны имеет наиболее интенсивное значение, и разделяя измерение на каждой полосе длины волны на это максимальное значение. Затем сохраните спектральные данные в качестве файла DAT.
После завершения, не смешивайте данные спектрального изображения. Несмешающий шаг будет генерировать изобилие изображения для каждого флуоресцентного ярлыка, где изобилие количество относительного флуоресцентного сигнала на изображении от предполагаемой этикетки. Затем откройте каждое несмешаемое изображение, чтобы визуально проверить распределение чистых компонентов.
Сравните величину изображения ошибки с величиной несмешанных изображений. Если величина изображения ошибки похожа на несмешаемые изображения изобилия, сигналы в данных спектрального изображения не могут быть точно учтены. Наконец, убедитесь, что нет неопознанных остаточных структур, сравнив изображение ошибки с несмешанными изображениями.
При правильной работе спектральный процесс немиксирования позволяет разделение спектрального стека изображения на соответствующие вклады от каждой метки флуоресценции. Здесь, несмешанный спектральный набор изображений с отдельными изображениями подчеркнув дыхательных путей гладкой мышечной клетки аутофторесценции, зонд GCaMP и митохондриальной этикетке. Существует высокая погрешность, связанная с ядерными и перинуклеарными областями клеток, указывающими на то, что измеренные спектры этих областей не очень хорошо учитываются спектрами в спектральной библиотеке.
Чистые спектры, собранные из помеченных клеток, которые также аутофторесцентные, скорее всего, загрязняют спектральный профиль для чистого компонента. Здесь можно увидеть разницу в несмешии с чистыми спектрами, загрязненными аутофторесценцией, по сравнению с исправленными чистыми спектрами после масштабируемого вычитания. Правильное получение данных имеет важное значение, когда изображения чувствительных образцов, поскольку они могут выжить только один сеанс изображения в отличие от фона и элементов управления, которые могут быть reimaged.
Убедитесь, что надлежащие настройки оборудования и приобретения предопределены как можно больше. В качестве следующего шага видео, созданные из данных замедленного действия, полученных с помощью этой системы, могут быть использованы для отслеживания флуоресцентных источников в скрытых местах с течением времени, таких как локализация сигнала второго мессенджера. Позаботьтесь при использовании мощных источников света, чтобы избежать воздействия глаз.
Кроме того, не забудьте носить надлежащие перчатки при обработке биологических этикеток.
