Это комплексные протокольные средства, генерация сырых импульсов и использование специфических для пациента культур из мононуклеарных клеток периферической крови. Эта тактика воспроизводима и проста в использовании, особенно для начинающих. И не требуют, специальной экспертизы в балладах о стволовых клетках или сердечно-сосудистой медицине.
Наш протокол может быть использован для генерации специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови, которые могут быть использованы для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний и тестирования сердечной токсичности новых лекарств. Этот протокол требует длительной приверженности поддержанию перепрограммирования стволовых клеток и направленной дифференцировке. Тем не менее, вы действительно цените свои усилия.
Когда вы видите бьющиеся кардиомиоциты в блюде. Когда человеческие колонии iPSC достигают более 90% конфлюентности, промывайте каждую лунку тремя миллилитрами DPBS перед обработкой клеток одним миллилитром 0,5 миллимолярной ЭДТА в DPBS на лунку при 37 градусах Цельсия. Через пять-восемь минут добавьте по одному миллилитру проходной среды iPSC в каждую лунку и вручную вытесните ячейки.
Перенос от 600 до 900 микролитров клеток в отдельные Уэллсы имеют базальную мембрану, покрытую шестью пластинами скважины для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Затем обновляйте культуры двумя миллилитрами полной среды E8 каждый день в течение трех-четырех дней. Когда культура достигнет слияния, замените среду двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов, по два на лунку.
На второй день замените супернатанты двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов. На третий день замените супернатанты двумя миллилитрами тридифференцировочной среды кардиомиоцитов. На пятый день.
Замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов один. С седьмого по 10-й день замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов четыре. На 11 и 13 день.
При сокращении клеток заменяют супернатант двумя миллилитрами кардиомиоциферировочной среды пять. В 15, 17, 19 и 21 дни. Замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов четыре.
После предварительной культивации с полной средой крови в течение семи дней ПБМК становятся большими с видимыми ядрами и цитоплазмой, что указывает на то, что они готовы к трансфекции с факторами перепрограммирования вируса Сендай. После введения в полную среду E8. Полностью перепрограммированные клетки прикрепятся и начнут образовывать колонии.
После четырех-пяти проходов из перепрограммированных клеток образуются высокочистые колонии iPSC с очень небольшим количеством дифференцированных клеток. На этом этапе большинство клеток являются OCT4 и NANOG положительными, что свидетельствует об их плюрипотении. Биение кардиомиоцитов обычно наблюдается после 12 дней дифференцировки.
После глюкозного голодания и повторного покрытия iPSC кардиомиоциты проявляют спонтанное биение и выровненную саркомерную структуру с интеркалированным сердечным тропонином Т и экспрессией альфа-актинина. Колонии сохраняют свою чистоту, о чем свидетельствует их выражение тропонина Т. Хотя iPSC кардиомиоциты относительно незрелые по сравнению со взрослыми кардиомиоцитами.
Они демонстрируют желудочковые и предсердные потенциалы действия, измеряемые оптовым пластырем, зажимом. Желудочковые кардиомиоциты экспрессируют миозин легкой цепью два, тогда как предсердные iPSC кардиомиоциты отмечены экспрессией NR2F2. Активация Wnt стимулирует деление клеток и способствует экспрессии регуляторов клеточного цикла.
Интересно, что активация Wnt также индуцирует устойчивую пролиферацию ранних кардиомиоцитов iPSC в течение двух проходов по сравнению с контрольной группой, хотя эта пролиферативная способность со временем уменьшается. Убедитесь, что PBMS увеличены с помощью прозрачной ядерной и цитоплазмы, прежде чем будут введены векторы перепрограммирования iPSC, поскольку состояние PBM имеет решающее значение для перепрограммирования iPSC. Кардиомиоциты, специфичные для пациента, ценны для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний in vitro и для обеспечения тонны донорских клеток для терапии стволовыми клетками сердца.
