В головном мозге пара нейронов часто образуют несколько синаптических контактов, что называется синаптической множественностью. Однако точное изучение синаптического многообразия требует технически сложных экспериментов. Этот протокол описывает простой метод для валовой оценки синаптической множественности с помощью цельноклеточного патч-зажима электрофизиологии.
Этот метод может быть применен к любому виду и области мозга для исследования синаптической множественности. Этот метод требует базовых навыков в электрофизиологии цельноклеточного патч-зажима. Получение высококачественных записей с низкой и стабильной устойчивостью к доступу имеет решающее значение для точной интерпретации данных.
Чтобы получить конфигурацию цельных ячеей, поместите записывающую пипету чуть выше ломтика и связьте ток пипетки в режиме зажима напряжения. Применить небольшое положительное давление на пипетки, и заблокировать стопкок. Затем выберите здоровую клетку с нетронутой мембраной и подойдите к ткани с пипеткой.
Положительное давление должно вызвать небольшое нарушение на ткани. Медленно приближай пипетку к клетке диагональным движением до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется небольшая ямочка. Затем отпустите блокировку положительного давления.
Клетка начнет образовывать уплотнение, и сопротивление увеличится выше одного гигаома. В зажиме напряжения держите ячейку на уровне минус 68 милливольт. Впоследствии слегка вытащите пипетки из клетки по диагонали, чтобы снять избыточное давление.
Компенсируют быструю и медленную емкость пипетки. Нанесите краткое всасывание через трубку, соединенную с держатель пипетки, чтобы прорваться через клетку и получить конфигурацию цельных клеток. Затем переключитесь на клеточный режим на мембранном тестовом окне в программном обеспечении для сбора и анализа данных электрофизиологии.
Поддерживайте температуру записывающей ванны при температуре от 27 до 30 градусов по Цельсию и скорость потока от 1,5 до двух миллилитров в минуту для последующих экспериментов. В множественности синапса, потенциал действия синхронизирует высвобождение нейромедиатора и генерирует больший постсинаптический ток. Блокирование потенциала действия и кальциезависимых везикулярных релиз с TTX и кадмия предотвращает постсинаптический ток суммирования и уменьшает амплитуду.
Когда нет множественности, потенциал действия блокировки не изменит амплитуды. В эксперименте один, чтобы оценить множественность, держать клетку на уровне минус 68 милливольт, в то время как perfusing его с низким содержанием кальция aCSF. Запись спонтанных EPSCs, по крайней мере пять минут, чтобы обеспечить стабильный базовый уровень.
Затем добавьте 30 микромоляров 4-AP в aCSF, чтобы увеличить действие потенциально зависимых событий, и записывают спонтанные EPSCs в течение по крайней мере 10 минут, чтобы получить полный эффект препарата. Затем добавьте 0,5 микромоляров TTX и 10 микромоляров кадмия в aCSF с 4-AP, и записывают миниатюрные EPSCs, по крайней мере 10 минут. Для офлайн-анализа используйте последнюю минуту базового уровня непосредственно перед применением 4-AP, 10-й минуты приложения 4 AP и 10-й минуты применения TTX.
В этом эксперименте внеклеточный кальций заменяется стронцием для десинхронизации высвобождения синаптических пузырьков. Поэтому, если множественность присутствует, это должно уменьшить амплитуду постсинаптических течений. В эксперименте два, запись спонтанных EPSCs, по крайней мере пять минут, в то время как perfusing клетки с нормальным кальцием aCSF.
Чтобы десинхронизировать высвобождение пузырьков, начните перфузировать клетку с помощью стронция aCSF и замечайте спонтанные EPSCs. Для автономного анализа, чтобы определить, является ли большая амплитуда спонтанной EPSCs из-за синхронного выпуска пузырьков, сравнить последнюю минуту базовой линии на 10-й минуте применения стронция aCSF. Множественность может включать многовековой релиз, который вызывает более высокую концентрацию нейромедиатора в синаптической расщелине.
Добавление гамма-DGG, антагонист рецепторов АМРА низкой сродства, приводит к менее эффективному ингибированию больших многоквантальных по сравнению с меньшими неколичественными постсинаптическими токами. Без мультивесяного высвобождения гамма-DGG будет одинаково эффективна на больших и малых постсинаптических токах. В третий эксперимент, чтобы проверить на мультивесякный релиз, запись спонтанных EPSCs в низкой кальция aCSF, по крайней мере пять минут.
Добавьте 30 микромоляров 4-AP в aCSF через систему перфузии. Запись спонтанных EPSCs, по крайней мере 10 минут. Затем добавьте 200 микромоляров гамма-DGG в aCSF с 4-AP, и зареги данными спонтанных EPSCs, по крайней мере 10 минут.
В качестве контрольного эксперимента в отдельной клетке повторите процедуры, но примените низкую концентрацию DN'X вместо гамма-DGG. Для автономного анализа проанализируйте последнюю минуту каждого применения препарата. Взрывы синаптической активности могут временно увеличить спонтанное действие потенциальной стрельбы и выпустить вероятность стимулированных афферентов.
Если нейроны обладают множественностью, увеличение потенциалов действия должно привести к переходному увеличению амплитуды постсинаптических течений. В эксперименте четыре, запись спонтанных EPSCs в нормальном кальция aCSF. Чтобы увеличить потенциальную стрельбу, стимулировать афферентов с помощью монополярного стеклянного электрода, наполненного aCSF со скоростью 20 герц в течение двух секунд, и повторить 10 раз с межвзрывом интервалом 20 секунд.
Для анализа используйте 5000 миллисекунд спонтанных EPSCs до первого стимула в качестве базового и сравнить с 10 до 300 миллисекунд спонтанных EPSCs после окончательного стимула. Затем возьмите среднюю амплитуду и изменение частоты в течение 10 испытаний. Анализ спонтанных EPSCs и миниатюрных EPSCs с помощью программы, которая обнаруживает и анализирует синаптические токи.
Используйте предлагаемые параметры обнаружения и функцию беспосадочного анализа для обнаружения АМРА-рецепторов опосредованного EPSCs. Вручную сканируйте каждую запись, чтобы убедиться, что программа точно определяет каждое событие. Экспортируйте данные о событиях, копируя их на буфер обмена, и вставьте их в программное обеспечение для управления данными.
Затем рассчитайте среднюю частоту и амплитуду для каждого медикаментозного лечения и выполните соответствующие статистические анализы. В примере, показанном здесь, 4-AP увеличивает как амплитуду, так и частоту спонтанных EPSCs. Последующее применение TTX и кадмия уменьшает как амплитуду, так и частоту.
Вот распределение спонтанной амплитуды EPSC из записи. В гипоталамические нейроны рассмотрены здесь, амплитуда и частота базовых и TTX условия одинаковы, предполагая, что базовые спонтанные EPSCs содержат очень мало действий потенциально зависимых EPSCs. Соответственно, последующие эксперименты могут сравнить разницу между базовым и 4-AP для измерения множественности.
Сила синаптической передачи может быть временно увеличена очередями синаптической активности. Для исследования множественности в более физиологических условиях, афферентная стимуляция может быть использована для увеличения потенциального действия стрельбы и высвобождения вероятности. Вот резюме спонтанных epSC частоты и амплитуды изменения после синаптической стимуляции.
Стабильные записи имеют важное значение для точной интерпретации данных. Опишите данные, если сопротивление доступа изменяется более чем на 20% во время записи, так как это может сбить с толку анализ. Этот протокол предлагает простой способ оценки синаптической множественности, которая является ключевым фактором, определяющим синаптической эффективности и ее пластичности в различных физиологических и патофизиологических условиях.
