Beyinde, nöronların bir çift genellikle sinaptik çokluk denir birden fazla sinaptik temas, formu. Ancak, sinaptik çokluğun hassas incelenmesi teknik olarak zorlu deneyler gerektirir. Bu protokol, tüm hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisi kullanılarak sinaptik çokluğun brüt tahmini için basit bir yöntem tanımlanmaktadır.
Bu yöntem sinaptik çokluğu araştırmak için herhangi bir tür ve beyin bölgesine uygulanabilir. Bu yöntem, tüm hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisinde temel beceriler gerektirir. Düşük ve kararlı erişim direncine sahip yüksek kaliteli kayıtların elde edilmesi, verilerin doğru yorumlanması için çok önemlidir.
Tüm hücre yapılandırmasını elde etmek için, kayıt pipetini dilimin hemen üzerine yerleştirin ve pipet akımını voltaj kelepçesi moduna ayırın. Pipete hafif pozitif basınç uygulayın ve stopcock kilitleyin. Daha sonra, sağlam bir membran ile sağlıklı bir hücre seçin ve pipet ile doku yaklaşım.
Pozitif basınç dokuda hafif bir bozulmaya neden olmalıdır. Hücre yüzeyinde küçük bir gamze oluşana kadar pipeti çapraz hareketle yavaşça hücreye yaklaştırın. Sonra, pozitif basınç kilidi bırakın.
Hücre bir mühür oluşturmaya başlayacak ve direnç bir gigaohm üzerinde artacak. Voltaj kıskacında, hücreyi eksi 68 milivoltta tutun. Daha sonra, aşırı basıncı kaldırmak için pipeti çapraz olarak hücreden hafifçe çekin.
Hızlı ve yavaş pipet kapasitansını telafi edin. Hücreyi kırmak ve tam hücre yapılandırması elde etmek için pipet tutucuya bağlı tüp emerek kısa bir emme uygulayın. Daha sonra, elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımında membran test penceresindeki hücre moduna geçin.
Kayıt banyosunun sıcaklığını 27 ila 30 santigrat derece, akış hızını ise sonraki deneyler için dakikada 1,5 ila iki mililitrede koruyun. Çokluk sinaps, bir eylem potansiyeli nörotransmitter salınımı senkronize ve daha büyük bir postsinaptik akım oluşturur. TTX ve kadmiyum ile etki potansiyelinin ve kalsiyuma bağımlı veziküler salınımın engellenmesi postsinaptik akım özetini önler ve genliği azaltır.
Çokluk olmadığında, engelleme eylem potansiyeli genliği değiştirmez. Deneyde, çokluğu tahmin etmek için, düşük kalsiyum aCSF ile perfüzyon sırasında eksi 68 milivolt hücre tutun. Kararlı bir taban çizgisi sağlamak için spontan EPSC'leri en az beş dakika kaydedin.
Daha sonra, eylem potansiyeline bağlı olayları artırmak için aCSF'ye 30 mikromolar 4-AP ekleyin ve tam ilaç etkisini elde etmek için spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Daha sonra, 4-AP ile aCSF'ye 0,5 mikromolar TTX ve 10 mikromolar kadmiyum ekleyin ve minyatür EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Çevrimdışı çözümleme için, 4-AP uygulamasından hemen önce taban çizgisinin son bir dakikasını, 4-AP uygulamasının 10.
Bu deneyde, ekstrasellüler kalsiyum sinaptik veziküllerin salınımını senkronize etmek için stronsiyum ile değiştirilir. Bu nedenle, çokluk varsa, bu postsinaptik akımların genliğini azaltmalıdır. İkinci deneyde, hücreyi normal kalsiyum aCSF ile perfüzyon yaparken spontan EPSC'leri en az beş dakika kaydedin.
Vezikül salınımını senkronize etmek için hücreyi stronsiyum aCSF ile perfüzyona başlayın ve spontan EPSC'leri kaydedin. Çevrimdışı analiz için, büyük genlik spontan EPSC'lerin veziküllerin senkron salınımından kaynaklanıp kaynaklmadığını belirlemek için, taban çizgisinin son dakikasını stronsiyum aCSF uygulamasının 10. Çokluk multivesiküler salınım içerebilir, hangi sinaptik yarık yüksek nörotransmitter konsantrasyonu neden olur.
Gama-DGG eklenmesi, düşük afiniteli AMPA reseptör antagonisti, daha küçük uniquantal postsynaptic akımlara göre daha küçük multiquantal daha az etkili inhibisyonu yol açar. Multiveziküler salınım olmadan, gama-DGG daha büyük ve daha küçük postsinaptik akımlar üzerinde eşit derecede etkili olacaktır. Üçüncü deneyde, multivesiküler salınım ı test etmek için, spontan EPSC'leri düşük kalsiyumlu aCSF'de en az beş dakika kaydedin.
Perfüzyon sistemi ile aCSF'ye 30 mikromolar 4-AP ekleyin. Spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Daha sonra, 4-AP ile aCSF'ye 200 mikromolar gama-DGG ekleyin ve spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin.
Ayrı bir hücrede bir kontrol deneyi olarak, yordamları tekrarlayın, ancak gama-DGG yerine düşük konsantrasyonda DNQX uygulayın. Çevrimdışı analiz için, her ilaç uygulamasının son dakikasını analiz edin. Sinaptik aktivite patlamaları geçici olarak spontan eylem potansiyelini artırabilir ve uyarılmış afferents serbest olasılık.
Nöronlar çokluk sergilerse, etki potansiyellerinin artması postsinaptik akımların genliğinde geçici bir artışa neden olmalıdır. Dördüncü deneyde, normal kalsiyum aCSF'de spontan EPSC'leri kaydedin. Eylem potansiyelini artırmak için, aCSF ile doldurulmuş monopolar cam elektrotu kullanarak afferentleri iki saniye boyunca 20 hertz hızında uyarın ve 20 saniyelik bir ara aralıkla 10 kez tekrarlayın.
Analiz için, ilk uyarıcıdan önce temel olarak 5,000 milisaniyesi spontan EPSC'ler kullanın ve son uyarıcıdan sonraki 10 ila 300 milisaniyesi spontan EPSC'lerle karşılaştırın. Daha sonra, 10 deneme üzerinde ortalama genlik ve frekans değişikliği almak. Spontan EPSC'leri ve minyatür EPSC'leri sinaptik akımları algılayan ve analiz eden bir program kullanarak analiz edin.
AMPA reseptör aracılı EPSC'leri tespit etmek için önerilen algılama parametrelerini ve aralıksız analiz fonksiyonunu kullanın. Programın her olayı doğru bir şekilde algıladığından emin olmak için her kaydı el ile taz.rile. Olay verilerini panoya kopyalayarak dışa aktarın ve bir veri yönetimi yazılımına yapıştırın.
Ardından, her ilaç tedavisi için ortalama sıklığı ve genliği hesaplayın ve ilgili istatistiksel analizleri gerçekleştirin. Burada gösterilen bir örnekte, 4-AP spontan EPSC'lerin genliğini ve sıklığını artırır. TTX ve kadmiyum un sonraki uygulaması hem genliği hem de frekansı azaltır.
Burada kayıt spontan EPSC genlik dağılımıdır. Burada incelenen hipotalamik nöronlarda, bazal ve TTX koşullarının genliği ve sıklığı aynıdır, bu da bazal spontan EPSC'lerin çok az etki potansiyeline bağlı EPSC içerdiğini düşündürmektedir. Buna göre, sonraki denemeler çokluğu ölçmek için taban çizgisi ve 4-AP arasındaki farkı karşılaştırabilirsiniz.
Sinaptik iletimin gücü sinaptik aktivite patlamaları ile geçici olarak arttırılabilir. Daha fizyolojik koşullar altında çokluğu araştırmak için, afferent stimülasyon eylem potansiyel ateş ve serbest olasılık artırmak için kullanılabilir. Sinaptik stimülasyon sonrası spontan EPSC frekans ı ve genlik değişikliklerinin özetleri aşağıda verilmiştir.
Kararlı kayıtlar verilerin doğru yorumlanması için gereklidir. Giriş sırasında erişim direnci %20'den fazla değişirse verileri açıklayın, çünkü bu analizleri rahatsız edebilir. Bu protokol, farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda sinaptik etkinliğin ve plastisitenin önemli bir belirleyicisi olan sinaptik çokluğu tahmin etmek için basit bir yol sunar.
