Nel cervello, una coppia di neuroni spesso forma molteplici contatti sinaptici, che è chiamata molteplicità sinaptica. Tuttavia, un esame preciso della molteplicità sinaptica richiede esperimenti tecnicamente impegnativi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per la stima lorda della molteplicità sinaptica usando l'elettrofisiologia patch-clamp a celle intere.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi specie e area cerebrale per indagare la molteplicità sinaptica. Questo metodo richiede abilità di base nell'elettrofisiologia patch-clamp a cellule intere. Ottenere registrazioni di alta qualità con bassa e stabile resistenza agli accessi è fondamentale per un'interpretazione accurata dei dati.
Per ottenere la configurazione a cella intera, posizionare la pipetta di registrazione appena sopra la corrente della pipetta di sezione e offset in modalità morsetto di tensione. Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta e bloccare il fermaviere. Quindi, selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarsi al tessuto con la pipetta.
La pressione positiva dovrebbe causare un leggero disturbo sul tessuto. Avvicinare lentamente la pipetta alla cella con un movimento diagonale fino a formare una piccola fossetta sulla superficie della cella. Quindi, rilasciare il blocco di pressione positivo.
La cellula inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenterà sopra un gigaohm. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a meno 68 millivolt. Successivamente, allontanare leggermente la pipetta dalla cella in diagonale per rimuovere la pressione in eccesso.
Compensare la capacità di pipetta veloce e lenta. Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al supporto della pipetta per sfondare la cella e ottenere una configurazione a cella intera. Quindi, passare alla modalità cellulare nella finestra di test della membrana in un software di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia.
Mantenere la temperatura del bagno di registrazione a 27-30 gradi Celsius e la portata da 1,5 a due millilitri al minuto per gli esperimenti successivi. In una sinapsi molteplicista, un potenziale d'azione sincronizza il rilascio di neurotrasmettitori e genera una corrente postsinaptica più grande. Il potenziale di azione bloccante e il rilascio vescicolare dipendente dal calcio con TTX e cadmio prevengono la sommatoria della corrente postsinaptica e diminuiscono l'ampiezza.
Quando non c'è molteplicità, il potenziale di azione di blocco non cambierà l'ampiezza. Nell'esperimento uno, per stimare la molteplicità, tenere la cellula a meno 68 millivolt mentre la perfonde con aCSF a basso calcio. Registrare gli EPSC spontanei per almeno cinque minuti per garantire una linea di base stabile.
Successivamente, aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF per aumentare gli eventi di azione potenziali dipendenti e registrare EPSC spontanei per almeno 10 minuti per ottenere l'effetto farmacologico completo. Quindi, aggiungere 0,5 micromolari TTX e 10 micromolari cadmio all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC in miniatura per almeno 10 minuti. Per l'analisi offline, utilizzare l'ultimo minuto di linea di base immediatamente prima dell'applicazione di 4-AP, il 10 ° minuto dell'applicazione 4-AP e il 10 ° minuto dell'applicazione TTX.
In questo esperimento, il calcio extracellulare viene sostituito con stronzio per de sincronizzare il rilascio di vescicole sinaptiche. Pertanto, se la molteplicità è presente, questo dovrebbe diminuire l'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento due, registrare EPSC spontanei per almeno cinque minuti mentre si perfonde la cellula con il normale aCSF di calcio.
Per sincronizzare il rilascio di vescicola, iniziare a perfondere la cellula con aCSF stronzio e registrare EPSC spontanei. Per l'analisi offline, per determinare se gli EPSC spontanei di grande ampiezza sono dovuti al rilascio sincrono di vescicole, confrontare l'ultimo minuto della linea di base con il 10 ° minuto dell'applicazione aCSF stronzio. La molteplicità può comportare il rilascio multivesicolare, che causa una maggiore concentrazione di neurotrasmettitori nella fessura sinaptica.
L'aggiunta di gamma-DGG, un antagonista del recettore AMPA a bassa affinità, porta ad un'inibizione meno efficace di più grandi correnti postnaptiche uniquantali. Senza rilascio multivesicolare, gamma-DGG sarà ugualmente efficace su correnti postsinaptiche sempre più grandi. Nell'esperimento tre, per testare il rilascio multivesicolare, registrare EPSC spontanei in aCSF a basso calcio per almeno cinque minuti.
Aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF attraverso il sistema di perfusione. Registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti. Quindi, aggiungere 200 micromolari gamma-DGG all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti.
Come esperimento di controllo in una cella separata, ripetere le procedure, ma applicare una bassa concentrazione di DNQX anziché gamma-DGG. Per l'analisi offline, analizza l'ultimo minuto di ogni applicazione farmacologica. Raffiche di attività sinaptica possono aumentare transitoriamente il potenziale di azione spontanea sparando e rilasciando la probabilità degli afferenti stimolati.
Se i neuroni mostrano molteplicità, l'aumento dei potenziali d'azione dovrebbe causare un aumento transitorio dell'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento quattro, registrare EPSC spontanei nel calcio normale aCSF. Per aumentare il potenziale d'azione, stimolare gli afferenti utilizzando un elettrodo di vetro monopolare riempito con aCSF ad una velocità di 20 hertz per due secondi e ripetere 10 volte con un intervallo inter-burst di 20 secondi.
Per l'analisi, utilizzare EPSC spontanei di 5.000 millisecondi prima del primo stimolo come linea di base e confrontarli con gli EPSC spontanei da 10 a 300 millisecondi dopo lo stimolo finale. Quindi, prendi l'ampiezza media e il cambio di frequenza in 10 prove. Analizza EPSC spontanei ed EPSC in miniatura utilizzando un programma che rileva e analizza le correnti sinaptiche.
Utilizzare i parametri di rilevamento suggeriti e la funzione di analisi non-stop per rilevare gli EPSC mediati dal recettore AMPA. Scansiona manualmente ogni registrazione per assicurarti che il programma rilevi con precisione ogni evento. Esportare i dati dell'evento copiarli negli Appunti e incollarli in un software di gestione dei dati.
Successivamente, calcolare la frequenza media e l'ampiezza per ogni trattamento farmacologico ed eseguire le analisi statistiche pertinenti. In un esempio mostrato qui, 4-AP aumenta sia l'ampiezza che la frequenza degli EPSC spontanei. La successiva applicazione del TTX e del cadmio diminuisce sia l'ampiezza che la frequenza.
Ecco la distribuzione dell'ampiezza EPSC spontanea dalla registrazione. Nei neuroni ipotalamici qui esaminati, l'ampiezza e la frequenza delle condizioni di base e TTX sono le stesse, suggerendo che gli EPSC spontanei di base contengono pochissimi EPSC potenziali-dipendenti dall'azione. Di conseguenza, gli esperimenti successivi possono confrontare la differenza tra basale e 4-AP per misurare la molteplicità.
La forza della trasmissione sinaptica può essere aumentata transitoriamente da raffiche di attività sinaptica. Per studiare la molteplicità in condizioni più fisiologiche, la stimolazionefferente può essere utilizzata per aumentare la probabilità di attivazione e rilascio potenziale di azione. Ecco i riassunti dei cambiamenti spontanei di frequenza e ampiezza dell'EPSC a seguito della stimolazione sinaptica.
Registrazioni stabili sono essenziali per un'interpretazione accurata dei dati. Descrivere i dati se la resistenza all'accesso cambia di oltre il 20% durante la registrazione, in quanto ciò potrebbe confondere l'analisi. Questo protocollo offre un modo semplice per stimare la molteplicità sinaptica, che è un fattore determinante dell'efficacia sinaptica e della sua plasticità in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatiche.
