No cérebro, um par de neurônios frequentemente formam múltiplos contatos sinápticos, o que é chamado de multiplicidade sináptica. No entanto, o exame preciso da multiplicidade sináptica requer experimentos tecnicamente desafiadores. Este protocolo descreve um método simples para estimativa bruta da multiplicidade sináptica usando eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras.
Este método pode ser aplicado a qualquer espécie e área cerebral para investigar a multiplicidade sináptica. Este método requer habilidades básicas na eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras. A obtenção de gravações de alta qualidade com baixa e estável resistência ao acesso é fundamental para a interpretação precisa dos dados.
Para obter a configuração de células inteiras, coloque a pipeta de gravação logo acima da corrente de pipeta de corte e compense a corrente de pipeta no modo de fixação de tensão. Aplique uma leve pressão positiva na pipeta e bloqueie a torneira. Em seguida, selecione uma célula saudável com uma membrana intacta, e aproxime-se do tecido com a pipeta.
A pressão positiva deve causar um leve distúrbio no tecido. Aproxime lentamente a pipeta da célula em um movimento diagonal até que uma pequena covinha se forme na superfície da célula. Em seguida, solte o bloqueio de pressão positivo.
A célula começará a formar uma vedação, e a resistência aumentará acima de um gigaohm. No grampo de tensão, segure a célula a menos 68 milvolts. Posteriormente, puxe ligeiramente a pipeta para longe da célula diagonalmente para remover o excesso de pressão.
Compensar a capacidade rápida e lenta da pipeta. Aplique uma breve sucção através do tubo conectado ao suporte da pipeta para quebrar a célula e obter uma configuração de célula inteira. Em seguida, mude para o modo celular na janela de teste de membrana em um software de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos.
Mantenha a temperatura do banho de gravação em 27 a 30 graus Celsius e a vazão em 1,5 a dois mililitros por minuto para experimentos subsequentes. Em uma sinapse multiplicidade, um potencial de ação sincroniza a liberação de neurotransmissores e gera uma corrente postsináptica maior. O potencial de ação de bloqueio e a liberação vesicular dependente de cálcio com TTX e cádmio impedem a soma da corrente postsiática e diminuem a amplitude.
Quando não há multiplicidade, o potencial de ação de bloqueio não mudará a amplitude. No experimento um, para estimar a multiplicidade, mantenha a célula a menos 68 milvolts enquanto a perfuz com aCSF de baixo cálcio. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos para garantir uma linha de base estável.
Em seguida, adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF para aumentar eventos potenciais dependentes da ação e registigue EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos para obter o efeito completo da droga. Em seguida, adicione 0,5 micromolars TTX e 10 micromolars de cádmio ao aCSF com 4-AP, e registe os EPSCs em miniatura por pelo menos 10 minutos. Para análise offline, use o último minuto da linha de base imediatamente antes da aplicação do 4-AP, o 10º minuto do aplicativo 4-AP e o 10º minuto do aplicativo TTX.
Neste experimento, o cálcio extracelular é substituído por estrôncio para dessincronizar a liberação de vesículas sinápticas. Portanto, se a multiplicidade estiver presente, isso deve diminuir a amplitude das correntes postsinásticas. No experimento dois, regise EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos enquanto perfusa a célula com aCSF de cálcio normal.
Para dessincronizar a liberação vesícula, comece a perfumar a célula com estrôncio aCSF e regis frequentes espontâneas. Para análise offline, para determinar se os EPSCs espontâneos de grande amplitude são devido à liberação síncrona de vesículas, compare o último minuto da linha de base com o 10º minuto do aplicativo estrôncio aCSF. A multiplicidade pode envolver liberação multivesicular, o que causa maior concentração de neurotransmissores na fissura sináptica.
A adição de gama-DGG, um antagonista receptor AMPA de baixa afinidade, leva a uma inibição menos eficaz de correntes pós-sinápticas uniquantais menores. Sem a versão multivesicular, o gama-DGG será igualmente eficaz em correntes postsináspticas maiores e menores. No experimento três, para testar a liberação multivesicular, registos espontâneos em aCSF de baixo cálcio por pelo menos cinco minutos.
Adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF através do sistema de perfusão. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos. Em seguida, adicione 200 micromolars gama-DGG ao aCSF com 4-AP, e regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos.
Como um experimento de controle em uma célula separada, repita os procedimentos, mas aplique uma baixa concentração de DNQX em vez de gama-DGG. Para análise offline, analise o último minuto de cada aplicação de medicamentos. Rajadas de atividade sináptica podem aumentar transitoriamente a potencial de ação espontânea de disparo e probabilidade de liberação dos diferentes aferentes estimulados.
Se os neurônios apresentarem multiplicidade, o aumento dos potenciais de ação deve causar um aumento transitório na amplitude das correntes postsináspticas. No experimento quatro, registos espontâneos em aCSF de cálcio normal. Para aumentar o potencial de disparo de ação, estimule os aferentes usando um eletrodo de vidro monopolar cheio de aCSF a uma taxa de 20 hertz por dois segundos, e repita 10 vezes com um intervalo entre rajadas de 20 segundos.
Para análise, use EPSCs espontâneos de 5.000 milissegundos antes do primeiro estímulo como linha de base e compare com os EPSCs espontâneos de 10 a 300 milissegundos após o estímulo final. Em seguida, tome a amplitude média e a mudança de frequência ao longo de 10 ensaios. Analise EPSCs espontâneos e EPSCs em miniatura usando um programa que detecta e analisa correntes sinápticas.
Use os parâmetros de detecção sugeridos e a função de análise sem escalas para detectar EPSCs mediados por receptores AMPA. Escaneie manualmente cada gravação para garantir que o programa esteja detectando com precisão cada evento. Exporte os dados do evento copiando-os para a área de transferência e cole-os em um software de gerenciamento de dados.
Em seguida, calcule a frequência média e a amplitude de cada tratamento medicamentoso e realize as análises estatísticas relevantes. Em um exemplo mostrado aqui, o 4-AP aumenta tanto a amplitude quanto a frequência de EPSCs espontâneos. A aplicação subsequente de TTX e cádmio diminui tanto a amplitude quanto a frequência.
Aqui está a distribuição da amplitude espontânea do EPSC a partir da gravação. Nos neurônios hipotalâmicos aqui examinados, a amplitude e a frequência das condições de linha de base e TTX são as mesmas, sugerindo que os EPSCs espontâneos da linha de base contêm pedênicos de ação potenciais dependentes dos EPSCs. Assim, experimentos subsequentes podem comparar a diferença entre linha de base e 4-AP para medir a multiplicidade.
A força da transmissão sináptica pode ser aumentada transitoriamente por rajadas de atividade sináptica. Para investigar a multiplicidade em condições mais fisiológicas, a estimulação aferente pode ser usada para aumentar a probabilidade de disparo e liberação de ações. Aqui estão os resumos das frequência espontâneas e mudanças de amplitude após a estimulação sináptica.
Gravações estáveis são essenciais para uma interpretação precisa dos dados. Descreva os dados se a resistência de acesso mudar em mais de 20% durante o registro, pois isso pode confundir a análise. Este protocolo oferece uma maneira simples de estimar a multiplicidade sináptica, que é um determinante fundamental da eficácia sináptica e sua plasticidade em diferentes condições fisiológicas e fioficológicas.
