脳では、ニューロンのペアはしばしばシナプス多重度と呼ばれる複数のシナプス接触を形成する。しかし、シナプス多重度の精密な検査には、技術的に困難な実験が必要です。このプロトコルは全細胞パッチクランプ電気生理学を用いたシナプス多重度の総推定のための簡単な方法を記述する。
この方法は、シナプス多重度を調査するために、任意の種および脳領域に適用することができる。この方法は、全細胞パッチクランプ電気生理学の基本的なスキルを必要とします。低く、安定したアクセス抵抗で高品質の記録を得ることは、データの正確な解釈のために重要です。
全セル構成を取得するには、録音ピペットをスライスの上に置き、ピペット電流を電圧クランプモードでオフセットします。ピペットにわずかな正圧を加え、栓をロックします。次に、無傷の膜を有する健康な細胞を選択し、ピペットで組織に近づく。
陽圧は組織に若干の障害を引き起こすはずです。細胞表面に小さなディンプルが形成されるまで、ピペットを斜めの動きでゆっくりと細胞に近づけます。次に、陽圧ロックを解除します。
セルはシールを形成し始め、抵抗は1ギガオームを超えて増加します。電圧クランプで、セルをマイナス68ミリボルトで保持します。その後、ピペットを細胞から斜めにわずかに引き離し、余分な圧力を取り除きます。
速く、遅いピペットの容量を補う。ピペットホルダーに接続されたチューブを通して短い吸引を施して、細胞を突破し、全細胞構成を得ます。次に、電気生理学データ取得および解析ソフトウェアで膜試験ウィンドウ上の細胞モードに切り替えます。
その後の実験では、記録浴の温度を摂氏27~30度、流量を1分あたり1.5~2ミリリットルに保ちます。多重度シナプスでは、作用電位は神経伝達物質放出を同期させ、より大きなポストナプティック電流を生成する。TTXおよびカドミウムによるブロッキング作用電位およびカルシウム依存性の小胞放出は、ポストナプティック電流の総和を妨げ、振幅を減少させる。
多重度がない場合、ブロックアクション電位は振幅を変えない。実験1では、多重度を推定するために、細胞をマイナス68ミリボルトで保持し、低カルシウムaCSFを浸透させます。自発性のEPSを少なくとも5分間記録して、安定したベースラインを確保します。
次に、30マイクロモル4-APをaCSFに加え、作用電位依存事象を増加させ、自発的なエプチクを少なくとも10分間記録して薬物効果を完全に得る。次に、4-APでaCSFに0.5マイクロモルTTXと10マイクロモルカドミウムを加え、ミニチュアのEPSCを少なくとも10分間記録します。オフライン分析の場合は、4-AP の適用直前のベースラインの最後の 1 分、4-AP アプリケーションの 10 分、および TTX アプリケーションの 10 分を使用します。
この実験では、シナプス小胞の放出を非同期化するために細胞外カルシウムをストロンチウムに置き換える。したがって、多重度が存在する場合、これは、ポストナプティック電流の振幅を減少させる必要があります。実験2では、通常のカルシウムaCSFで細胞を浸透させながら、少なくとも5分間自発的なEPSを記録する。
ベシクル放出を解除するには、ストロンチウムaCSFで細胞を浸透させ、自発的なEPSを記録します。オフライン解析では、大きな振幅の自発的なエプティックが小胞の同期放出によるものかどうかを判断するために、ベースラインの最後の1分間をストロンチウムaCSFアプリケーションの10分と比較します。多重度は多面的な放出を伴い、シナプス裂に高い神経伝達物質濃度を引き起こす。
低親和性AMPA受容体拮抗薬であるγ-DGGの添加は、小さな単一回の回価の心鼻波流に比べてより大きな多量体の効果的な阻害を招く。多面放出がなければ、ガンマ-DGGは大きく、より小さいポストナプティック電流に対して同様に有効である。実験3では、多面的な放出をテストするために、少なくとも5分間、低カルシウムaCSF中の自発的なエプチを記録する。
灌流システムを介してaCSFに30マイクロモル4-APを追加します。自発的なEPSを少なくとも10分間記録します。次に、4-AP を搭載した aCSF に 200 マイクロモルガンマ DGG を加え、少なくとも 10 分間、自発的なエプティクスを記録します。
別のセルでの制御実験として、手順を繰り返しますが、ガンマDGGの代わりに低濃度のDNQXを適用します。オフライン分析の場合は、各薬物アプリケーションの最後の分を分析します。シナプス活動のバーストは、一過性の自発的作用の潜在的な発火と刺激された発泡剤の放出確率を増加させることができます.
ニューロンが多重度を示す場合、作用電位の増加は、ポストナプティック電流の振幅の一過性増加を引き起こすはずです。実験4では、通常のカルシウムaCSFに自発的なエプティクスを記録する。作用電位焼成を高めるには、aCSFを充填した単極ガラス電極を2秒間20ヘルツの割合で刺激し、インターバースト間隔20秒で10回繰り返します。
分析には、最初の刺激の前に5,000ミリ秒の自発的なEPSをベースラインとして使用し、最終的な刺激の後の10〜300ミリ秒の自発的なEPSCと比較します。次に、平均振幅と周波数変化を10回の試行で行います。シナプス電流を検出して解析するプログラムを用いて、自発性のEPCやミニチュアEPCを解析します。
AMPA受容体媒介性のEPSを検出するために、推奨される検出パラメータとノンストップ解析機能を使用してください。各記録を手動でスキャンして、プログラムが各イベントを正確に検出していることを確認します。イベント データをクリップボードにコピーしてエクスポートし、データ管理ソフトウェアに貼り付けます。
次に、各薬剤治療の平均頻度と振幅を計算し、関連する統計分析を行います。ここに示す例では、4-AP は、自発的な EPS の振幅と周波数の両方を増加させます。TTXとカドミウムのその後の適用は振幅および頻度の両方を減少させる。
ここでは、記録からの自発的なEPSC振幅の分布です。ここで調べた視床下部ニューロンでは、ベースラインとTTX条件の振幅と周波数は同じであり、ベースラインの自発的なEPSCは非常に少数の作用電位依存性のEPSを含み、示唆している。したがって、その後の実験では、ベースラインと4-APの差を比較して多重度を測定することができる。
シナプス伝達の強度は、シナプス活性のバーストによって一過性増加することができる。より生理的条件下での多重度を調べるには、不感な刺激を用いて、作用電位の発火および放出確率を高めることができる。シナプス刺激に続く自発的なEPSC周波数と振幅変化の要約を次に示します。
データを正確に解釈するには、安定した記録が不可欠です。このデータは、分析を混乱させる可能性があるため、記録中にアクセス抵抗が 20% 以上変化した場合にデータを記述します。このプロトコルは、シナプス多重度を推定する簡単な方法を提供します, これは、異なる生理学的および病態生理学的条件におけるシナプス効果とその可塑性の重要な決定要因であります.
