Im Gehirn bilden ein Paar Von Neuronen oft mehrere synaptische Kontakte, die als synaptische Multiplizität bezeichnet wird. Eine genaue Untersuchung der synaptischen Vielfältigkeit erfordert jedoch technisch anspruchsvolle Experimente. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur groben Abschätzung der synaptischen Multiplizität mit Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie.
Diese Methode kann auf jede Art und Gehirnbereich angewendet werden, um synaptische Vielfalt zu untersuchen. Diese Methode erfordert Grundfertigkeiten in der Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Die Beschaffung hochwertiger Aufnahmen mit geringem und stabilem Zugriffswiderstand ist für die genaue Interpretation der Daten von entscheidender Bedeutung.
Um eine Ganzzellenkonfiguration zu erhalten, legen Sie die Aufnahmepipette knapp über der Scheibe und den Offsetpipettenstrom in den Spannungsklemmenmodus. Tragen Sie leichten positiven Druck auf die Pipette auf, und verriegeln Sie den Hahn. Wählen Sie als Nächstes eine gesunde Zelle mit einer intakten Membran aus und nähern Sie sich mit der Pipette dem Gewebe.
Der positive Druck sollte eine leichte Störung des Gewebes verursachen. Bringen Sie die Pipette in einer diagonalen Bewegung langsam näher an die Zelle heran, bis sich auf der Zelloberfläche ein kleines Grübchen bildet. Lösen Sie dann die positive Drucksperre.
Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden, und der Widerstand wird über einem Gigaohm steigen. In Spannungsklemme halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt. Ziehen Sie anschließend die Pipette leicht diagonal von der Zelle weg, um überdendruckbaren Druck zu entfernen.
Kompensieren Sie die schnelle und langsame Pipettenkapazität. Tragen Sie eine kurze Absaugung durch das Rohr auf, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um die Zelle zu durchbrechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erhalten. Wechseln Sie dann in einer elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analysesoftware in den Zellmodus im Membrantestfenster.
Halten Sie die Temperatur des Aufnahmebades bei 27 bis 30 Grad Celsius und die Durchflussrate bei 1,5 bis zwei Milliliter pro Minute für nachfolgende Experimente. In einer Multiplizitätssynapse synchronisiert ein Aktionspotenzial die Freisetzung von Neurotransmittern und erzeugt einen größeren postsynaptischen Strom. Blockierendes Wirkungspotenzial und kalziumabhängige vesikuläre Freisetzung mit TTX und Cadmium verhindert die postsynaptische Stromsumsumation und verringert die Amplitude.
Wenn es keine Multiplizität gibt, ändert das Blockieren des Aktionspotenzials die Amplitude nicht. In Experiment eins, um die Multiplizität zu schätzen, halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt, während Sie sie mit niedrigem Kalzium-aCSF durchdringen. Zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten.
Als nächstes fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP zum aCSF hinzu, um handlungspotentialabhängige Ereignisse zu erhöhen, und zeichnen Sie spontane EPSCs für mindestens 10 Minuten auf, um die volle Arzneimittelwirkung zu erzielen. Fügen Sie dann 0,5 Mikromolaren TTX und 10 Mikromolaren Cadmium zum aCSF mit 4-AP hinzu und nehmen Sie die Miniatur-EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Für die Offline-Analyse verwenden Sie die letzte 1 Minute der Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP, die 10. Minute der 4-AP-Anwendung und die 10. Minute der TTX-Anwendung.
In diesem Experiment wird extrazelluläres Kalzium durch Strontium ersetzt, um die Freisetzung synaptischer Vesikel zu desynchronisieren. Wenn eine Multiplizität vorhanden ist, sollte dies daher die Amplitude postsynaptischer Ströme verringern. In Experiment zwei nehmen Sie spontane EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, während sie die Zelle mit normalem Kalzium aCSF durchdringen.
Um die Freisetzung von Vesikel zu desynchronisieren, beginnen Sie mit der Durchlässigung der Zelle mit Strontium aCSF und nehmen Sie spontane EPSCs auf. Um zu ermitteln, ob die spontanen EPSCs mit großer Amplitude auf die synchrone Freisetzung von Vesikeln zurückzuführen sind, vergleichen Sie die letzte Minute der Baseline mit der 10. Minute der Strontium-aCSF-Anwendung. Die Multiplizität kann eine multivesikuläre Freisetzung beinhalten, die eine höhere Neurotransmitterkonzentration in der synaptischen Spalte verursacht.
Die Zugabe von Gamma-DGG, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten mit geringer Affinität, führt zu einer weniger wirksamen Hemmung größerer multiquantaler Ströme im Vergleich zu kleineren uniquantalen postsynaptischen Strömen. Ohne multivesikuläre Freisetzung wird Gamma-DGG bei größeren und kleineren postsynaptischen Strömen gleichermaßen wirksam sein. In Experiment drei, um die multivesikuläre Freisetzung zu testen, nehmen Sie spontane EPSCs in low-calcium aCSF für mindestens fünf Minuten auf.
Fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP über das Perfusionssystem zum aCSF hinzu. Nehmen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Fügen Sie dann 200 Mikromolaren Gamma-DGG zum aCSF mit 4-AP hinzu und zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf.
Als Kontrollexperiment in einer separaten Zelle wiederholen Sie die Prozeduren, wenden jedoch eine niedrige Konzentration von DNQX anstelle von Gamma-DGG an. Für die Offline-Analyse, analysieren Sie die letzte Minute jeder Anwendung. Ausbrüche synaptischer Aktivität können vorübergehend spontane Aktionspotenziale erhöhen, die die Wahrscheinlichkeit der stimulierten Afferents auslösen und loslassen.
Wenn Neuronen eine Vielzahl aufweisen, sollte die Zunahme der Aktionspotentiale zu einer vorübergehenden Erhöhung der Amplitude postsynaptischer Ströme führen. In Experiment vier nehmen Sie spontane EPSCs in normalem Kalzium-aCSF auf. Um das Wirkungspotenzial zu erhöhen, stimulieren Sie die Afferents mit einer monopolaren Glaselektrode, die mit einer CSF-Rate von 20 Hertz für zwei Sekunden gefüllt ist, und wiederholen Sie 10 Mal mit einem Inter-Burst-Intervall von 20 Sekunden.
Verwenden Sie für die Analyse 5.000 Millisekunden spontane EPSCs vor dem ersten Stimulus als Basiswert und vergleichen Sie die spontanen EPSCs von 10 bis 300 Millisekunden nach dem endgültigen Stimulus. Nehmen Sie dann die durchschnittliche Amplitude und Frequenzänderung über 10 Versuche. Analysieren Sie spontane EPSCs und Miniatur-EPSCs mit einem Programm, das synaptische Ströme erkennt und analysiert.
Verwenden Sie die vorgeschlagenen Erkennungsparameter und die Nonstop-Analysefunktion, um AMPA-Rezeptor-vermittelte EPSCs zu erkennen. Scannen Sie jede Aufzeichnung manuell, um sicherzustellen, dass das Programm jedes Ereignis genau erkennt. Exportieren Sie die Ereignisdaten, indem Sie sie in die Zwischenablage kopieren, und fügen Sie sie in eine Datenverwaltungssoftware ein.
Als Nächstes berechnen Sie die durchschnittliche Häufigkeit und Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und führen Die relevanten statistischen Analysen durch. In einem hier gezeigten Beispiel erhöht 4-AP sowohl die Amplitude als auch die Frequenz spontaner EPSCs. Die nachfolgende Anwendung von TTX und Cadmium verringert sowohl die Amplitude als auch die Frequenz.
Hier ist die Verteilung der spontanen EPSC-Amplitude aus der Aufnahme. In den hier untersuchten hypothalamischen Neuronen sind die Amplitude und Häufigkeit der Ausgangs- und TTX-Bedingungen identisch, was darauf hindeutet, dass die spontanen Basis-EPSCs nur sehr wenige handlungspotentialabhängige EPSCs enthalten. Dementsprechend können nachfolgende Experimente die Differenz zwischen Baseline und 4-AP vergleichen, um die Multiplizität zu messen.
Die Stärke der synaptischen Übertragung kann vorübergehend durch Ausbrüche der synaptischen Aktivität erhöht werden. Um die Multiplizität unter physiologischeren Bedingungen zu untersuchen, kann eine afferent Stimulation verwendet werden, um die potenzielle Abschuss- und Freisetzungswahrscheinlichkeit der Wirkung zu erhöhen. Hier sind die Zusammenfassungen der spontanen EPSC-Frequenz- und Amplitudenänderungen nach synaptischer Stimulation.
Stabile Aufnahmen sind für eine genaue Interpretation der Daten unerlässlich. Beschreiben Sie die Daten, wenn sich der Zugriffswiderstand während der Aufzeichnung um mehr als 20 % ändert, da dies die Analyse verwirren könnte. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, die synaptische Multiplizität zu schätzen, die ein wichtiger Determinant der synaptischen Wirksamkeit und ihrer Plastizität unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist.
