두뇌에서, 신경 쌍의 쌍은 수시로 시냅스 복합성에게 불린 다중 시냅스 접촉을 형성합니다. 그러나 시냅스 복합성에 대한 정확한 검사는 기술적으로 도전적인 실험이 필요합니다. 이 프로토콜은 전세포 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 시냅스 복합성의 총 추정을 위한 간단한 방법을 설명합니다.
이 방법은 시냅스 복합성을 조사하기 위해 모든 종과 뇌 영역에 적용 될 수있다. 이 방법은 전세포 패치 클램프 전기 생리학에서 기본적인 기술이 필요합니다. 낮은 안정적인 액세스 저항으로 고품질 레코딩을 얻는 것은 데이터의 정확한 해석에 매우 중요합니다.
전체 셀 구성을 얻으려면 기록 파이펫을 슬라이스 바로 위에 놓고 전압 클램프 모드에서 파이펫 전류를 오프셋합니다. 파이펫에 약간의 양압을 바르고 스톱콕을 잠급니다. 다음으로, 그대로 막으로 건강한 세포를 선택하고 파이펫으로 조직에 접근하십시오.
양압은 조직에 약간의 장애를 야기한다. 작은 보조제가 세포 표면에 형성될 때까지 피펫을 대각선 동작으로 셀에 더 가깝게 가져옵니다. 그런 다음 양압 잠금을 해제합니다.
셀은 씰을 형성하기 시작하고 저항은 하나의 기가옴 이상으로 증가합니다. 전압 클램프에서 셀을 마이너스 68 밀리볼트로 고정합니다. 이어서, 피펫을 세포에서 대각선으로 당겨 과도한 압력을 제거합니다.
빠르고 느린 파이펫 커패시턴스를 보상합니다. 파이펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 간단한 흡입을 적용하여 세포를 돌파하고 전세포 구성을 얻습니다. 그런 다음, 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어에서 멤브레인 테스트 창에 셀 모드로 전환한다.
기록 용 목욕의 온도를 섭씨 27~30도에서 유지하며, 후속 실험을 위해 분당 1.5~2밀리리터의 유속량을 유지한다. 복합성 시냅스에서, 행동 잠재력신경 전달 물질 방출을 동기화 하 고 더 큰 포스트 naptic 전류를 생성. TTX와 카드뮴으로 작용 잠재력 및 칼슘 의존성 혈관 방출을 차단하면 포스트냅틱 전류가 합산되지 않도록 하고 진폭을 감소시다.
다각성이 없는 경우 차단 작업 잠재력은 진폭을 변경하지 않습니다. 실험 1에서, 복합성을 추정하기 위하여는, 저칼슘 aCSF로 그것을 견딜 동안 영하 68 밀리볼트에서 세포를 보유합니다. 안정적인 기준선을 보장하기 위해 자발적인 EPSC를 최소 5분 동안 기록합니다.
다음으로, aCSF에 30개의 마이크로몰라 4-AP를 추가하여 작용 잠재력 에 의존하는 이벤트를 늘리고, 완전한 약물 효과를 얻기 위해 최소 10분 동안 자발적인 EPSC를 기록한다. 이어서, 4-AP로 aCSF에 0.5 마이크로몰라 TTX 및 10개의 마이크로몰라 카드뮴을 추가하고, 미니어처 EPSC를 최소 10분 동안 기록한다. 오프라인 분석을 위해 4-AP 적용 직전의 마지막 1분, 4-AP 애플리케이션의 10분, TTX 애플리케이션의 10분을 사용하십시오.
이 실험에서 세포외 칼슘은 시냅스 소포의 방출을 비동기화하기 위해 스트론튬으로 대체됩니다. 따라서 다각성이 있는 경우, 이것은 포스트냅스 전류의 진폭을 감소시켜야 한다. 실험 2에서는, 일반적인 칼슘 aCSF를 가진 세포를 perfusing하는 동안 적어도 5 분 동안 자발적인 EPSCs를 기록합니다.
소포 방출의 비동기화를 위해 스트론튬 aCSF로 셀을 인코딩하기 시작하고 자발적인 EPSC를 기록하십시오. 오프라인 분석을 위해, 큰 진폭 자발적 EPSC가 소포의 동기 방출때문인지 여부를 확인하려면 기준기의 마지막 순간을 스트론튬 aCSF 응용 프로그램의 10분에 비교한다. 다발성은 시냅스 갈라진 에서 더 높은 신경 전달 물질 농도를 일으키는 다발성 방출을 관련시킬 수 있습니다.
감마-DGG의 추가, 낮은 친화 AMPA 수용체 길항제, 작은 uniquantal 포스트 naptic 전류에 비해 더 큰 다콴탈의 덜 효과적인 억제로 이끌어 냅니다. 다각적 방출없이, 감마-DGG는 더 크고 작은 포스트 냅스 전류에 동등하게 효과적일 것입니다. 실험 3에서는 다각성 방출을 테스트하기 위해 저칼슘 aCSF에서 최소 5분 동안 자발적인 EPSC를 기록합니다.
관류 시스템을 통해 aCSF에 30 개의 미세 몰라 4-AP를 추가하십시오. 자발적인 EPSC를 최소 10분 동안 기록합니다. 그런 다음 4-AP로 200 개의 마이크로 몰라 감마-DGG를 aCSF에 추가하고 자발적인 EPSC를 최소 10 분 동안 기록합니다.
별도의 셀에서 대조군 실험으로서 절차를 반복하지만 감마-DGG 대신 DNQX의 낮은 농도를 적용한다. 오프라인 분석을 위해 각 약물 응용 프로그램의 마지막 순간을 분석합니다. 시냅스 활동의 버스트는 자극된 포렌트의 자발적인 작용 잠재적 발사 및 방출 확률을 일시적으로 증가시킬 수 있다.
뉴런이 복합성을 나타내는 경우, 행동 잠재력의 증가는 포스트 냅스 전류의 진폭의 일시적인 증가를 야기한다. 실험 4에서는 정상적인 칼슘 aCSF에서 자발적인 EPSC를 기록합니다. 작용 잠재력 발사를 증가시키기 위해 aCSF로 채워진 단극성 유리 전극을 2초 동안 20 헤르츠의 속도로 자극하고, 20초 의 인터버스트 간격으로 10회 반복합니다.
분석을 위해 첫 번째 자극 전에 5, 000밀리초 자발적 EPSC를 베이스라인으로 사용하고 최종 자극 후 10~300밀리초 의 자발적 EPSC와 비교합니다. 그런 다음 평균 진폭및 주파수 변화를 10번 이상 수행합니다. 시냅스 전류를 감지하고 분석하는 프로그램을 사용하여 자발적인 EPSC 및 소형 EPSC를 분석합니다.
AMPA 수용체 매개 EPSC를 검출하기 위해 제안된 검출 파라미터 및 논스톱 분석 기능을 사용합니다. 프로그램이 각 이벤트를 정확하게 감지하고 있는지 확인하기 위해 각 레코딩을 수동으로 검사합니다. 이벤트 데이터를 클립보드에 복사하여 내보내고 데이터 관리 소프트웨어에 붙여넣습니다.
다음으로, 각 약물 치료에 대한 평균 주파수 및 진폭을 계산하고 관련 통계 분석을 수행한다. 여기에 표시된 예에서 4-AP는 자발적인 EPSC의 진폭과 빈도를 모두 증가시킵니다. TTX와 카드뮴의 후속 적용은 진폭과 주파수를 모두 감소시다.
다음은 레코딩에서 자발적인 EPSC 진폭의 분포입니다. 여기서 조사된 시상 하부 뉴런에서 기준선 및 TTX 조건의 진폭및 주파수는 동일하며, 이는 기준선 자발적 EPSC에 잠재적 인 EPSC가 거의 포함되어 있지 않습니다. 따라서 후속 실험은 기준선과 4-AP 간의 차이를 비교하여 복합성을 측정할 수 있다.
시냅스 전송의 강도는 시냅스 활동의 버스트에 의해 일시적으로 증가 될 수있다. 더 많은 생리적 조건 하에서 복합성을 조사하기 위해, 포퍼런트 자극은 행동 잠재적 인 발사 및 방출 확률을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 다음은 시냅스 자극 다음의 자발적EPSC 주파수 및 진폭 변경 사항에 대한 요약입니다.
안정적인 기록은 데이터의 정확한 해석을 위해 필수적입니다. 이 분석을 혼동 할 수 있기 때문에, 기록 중에 액세스 저항이 20 % 이상 변경하는 경우 데이터를 설명합니다. 이 프로토콜은 시냅스 복합성을 추정하는 간단한 방법을 제공합니다, 이는 다른 생리학적 및 병리학 적 조건에서 시냅스 효능과 가소성의 주요 결정요인입니다.
