Эта процедура обеспечивает повторный оптический доступ к спинной гиппокамп живых мышей для изучения механизмов формирования памяти и вспомнить, пока они выполняют учебные задачи. Этот метод позволяет использовать световую микроскопию для изучения спинного гиппокампа живых мышей на микрометровом уровне пространственного разрешения продольно в течение нескольких недель. Потеря памяти является общей отличительной чертой некоторых заболеваний мозга, таких как болезнь Альцгеймера.
Понимание механизма формирования памяти и вспомнить может в конечном итоге помочь пациентам, страдающим от этих заболеваний. Этот метод может быть применен к другим системам животных с черепом, таких как мелкие млекопитающие. Мониторинг жизненно важных признаков во время операции по выживанию может быть как отвлекающим, так и стрессовым.
Возможно, было бы полезно сначала выполнить процедуру на мертвое животное, с тем чтобы сосредоточиться на более важных аспектах процедуры. Чтобы подготовить канюлю для визуализации, сначала вырежьте трубку из нержавеющей стали диаметром три миллиметра на металлическое кольцо длиной 1,6 миллиметра. Если края кольца не тупые после резки, файл из неровностей.
Затем используйте пару типсов, чтобы окунуть одну сторону металлического кольца в уф-излучение оптического клея. Затем распоить металлическое кольцо в центре стеклянной крышки с боковой стороной кольца, покрытой клеем касаясь крышки. Включите УФ лечения светодиодный блок драйвера и блеск 365 нанометров длины волны света на клей в течение одной минуты, чтобы вылечить клей.
Убедитесь, что все стороны кольца одинаково освещены, изменив направление источника света. После того, как клей затвердел, по крайней мере два часа, крепко удерживайте канюлю с открытого конца металлического кольца с помощью гемостата. Используя зубную дрель, оснащенную вращающимся файлом, свяйте излишки стеклянной крышки до тех пор, пока она не будет промыта по бокам кольца.
Подготовь необходимые инструменты и обезболивать мышь, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем удалите волосы и дезинфицировать кожу над головой мыши. Затем используйте ножницы и типсы, чтобы сделать небольшой разрез кожи головы в положении, близком к лямбде.
Двигайтесь боково в направлении ушей, затем рострально в направлении орбиты глаза, чтобы сформировать треугольник на sagittal оси примерно четыре миллиметра рострал к брегме. Нанесите на череп одну каплю лидокаина. Через две минуты, очистить periosteum и высушить череп с помощью ватного тампона.
Затем распорежьте ушные решетки, чтобы зафиксировать голову мыши. Используя микросверло с заусенцем шириной 0,5 миллиметра, сделайте небольшое отверстие в лобной кости напротив изображенного гиппокампа примерно в 1,5 миллиметра от сагиттального шва и двух миллиметров, вымяв из коронального шва. Затем винт 0,86 миллиметра шириной нержавеющей стали кости винт в отверстие черепа.
Защитите его на месте с помощью клея цемента. Пусть цемент высохнет в течение 30 секунд до минуты. Затем используйте трехмиллиметровую дрели трефина диаметром, чтобы сделать небольшое отверстие в теменной кости.
Распоите отверстие примерно на 1,5 миллиметра от сагиттального шва и два миллиметра дистал от шва ягненка. Аккуратно удалите костной лоскут. Затем удалите околивания с помощью типсов Дюмона.
Аблат кортикальной материи для достижения внешней капсулы. Используйте 19 калибровочных тупых игл, подключенных к вакуумный насос и орошения солевым раствором, чтобы избежать обезвоживания подвергаются ткани и смыть остатки крови после кровотечения будет решена. Сосать корковые ткани медленно около 50 до 100 микрон в то время, пока кора отделяется от капсулы подвергая волокна цинулума или мозоли корпуса.
Затем тщательно очистить спинные волокна до самых глубоких волокон, альвей гиппокампа подвергаются. Когда закончите, промойте ткань солевым раствором. Затем используйте тонкие типсы, чтобы окунуть нижнюю канюлю в солевой раствор и распоставить его над отверстием черепа.
Затем нажмите канюлю в череп, пока стеклянная обложка находится в контакте с волокнами. Высушите череп и нанесите на череп быстрый клей цемент, чтобы удержать канюлю на месте. Не забудьте также применить клей на краю канюлы, но будьте осторожны, чтобы не позволить клей запустить в канюлю.
После высыхания используйте стереотаксисную руку, чтобы располагать пластину держателя головы над канюлей при контакте с черепом. Приготовьте смесь зубного акрила, а затем применить его по всему черепу. Обложка весь открытый череп, винт и открытая кожа с зубным акрилом для стабилизации подготовки.
Через 15 минут нанесите съемную клеевую пленку на плиту держателя головы, чтобы предотвратить проникновение мусора в канюлю. Когда готовы к изображению мозга, снова следуйте вместе в сопроводительном текстовом протоколе для получения подробной информации об анестезии. После достаточного остекляемого, используйте типсы, чтобы тщательно удалить клейую пленку с пластины держателя головы.
Снимите пленку осторожно, чтобы избежать повреждения препарата. Затем распоимить мышь под микроскопом над нагревательной ковровой дорожкой и прикренить головную пластину к держателю. Нанесите мазь на глаза животного.
Затем очистите канюлю изображения с помощью шприца и тонкой иглы, чтобы сбросить деионизированную воду в канюлю с последующим удалением с помощью вакуумного насоса. Используйте низкие цели увеличения на большие рабочие расстояния, чтобы визуально проверить канюлю на наличие остаточной воды, грязи, целостности и наличия флуоресценции. Затем выровнять канюлю к оптической оси, регулируя углы руки держателя головы.
Переключитесь на цель 25X с численной диафрагмой 1,0 и четырехмиллиметровой рабочей дистанцией. Затем добавьте достаточно деионизированной воды в канюлю, чтобы заполнить его и поддерживать избыток воды на вершине канюли. Наконец, используйте два фотона возбуждения и изображения флуоресценции сигналов.
Здесь показан стек изображения 2P из трансгенного мозга мыши thy1-GFP. Thy1-GFP мышей выразить цитоплазмические расширения GFP под контролем Промоутер Thy1 в редких случайных популяции пирамидальных нейронов. Как правило, основная ось пирамидальных нейронов в спинном гиппокампе CA1 примерно перпендикулярна плоскости изображения XY.
Эти области вручную отображаются в трехмерном стеке с низким увеличением, показывающем рисунок выражения GFP в объеме ниже канюли изображения. Для продольного слежения определяется несколько областей мозга в поле зрения канюлы. Каждый регион соответствует площади примерно 240 на 240 микрометров и содержит от одного до семи дендритных сегментов.
На снимке серии показаны один микрометр z-шаг изображения стеки CA1 пирамидальных нейронов и базальных дендритов, приобретенных с разными интервалами времени в течение 14 дней. Тем не менее, более длительные продолжительности изображения и интервалы возможны. Хотя большинство изображений дендритных шипов в прослойке oriens, это также можно изображение дендритных шипов в косых дендритов слоя излучают.
Еще одним продолжением этого метода является изображение деятельности вызвали пластичность в CA1 пирамидальных нейронов путем введения спинной CA1 гиппокампа области с вирусным вектором. Это позволяет измерять пластичность сотен пирамидальных нейронов CA1 в каждом животном, показанном здесь как стек изображения 2P. Очень важно предотвратить повреждение гиппокампа при удалении чрезмерной ткани.
Кроме того, следует правильно разместить канюлю, чтобы обеспечить стабильную подготовку. Описанный препарат позволяет использовать различные виды оптических изображений, таких как миниатюрные микроскопы, которые могут быть имплантированы на голову животного. Это позволяет исследователю следить за нейронной активностью свободно движущихся животных.
Первоначально, техника была использована для изучения структурной пластичности в гиппокампе нейронов. Сегодня он реализуется в изучении нейронной активности и в других областях мозга.
