Наш протокол дает очень активный PCD, свободный от обнаруживаемых нуклеазы, которые могут быть использованы в любом растворе, где aqueous кислорода является загрязняющим веществом. Методы, которые мы используем, просты в репликации и гарантируют, что в продукте нет загрязняющих веществ нуклеазы. Для начала объедините в трубке один микролитер pVP91A-pcaHG PCD-плазмид и 20 микролитров коммерчески доступных E.coli BL21.
Флик трубки для смешивания, и поместите трубку на лед в течение пяти минут. Чтобы продолжить реакцию преобразования, поместите трубку в водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 секунд, затем на лед в течение двух минут. Добавить 80 микролитров SOC средств массовой информации, и встряхнуть при 225 об / мин и 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Далее, залить смесь реакции преобразования на LB-ампициллин агар, и использовать пластины распространитель для распространения смеси. Обложка пластины с крышкой, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 16 до 18 часов. После этого выберите одну колонию из тарелки и прививки в 50 микролитров LB-ампициллина в 250-миллилитровой колбе Эрленмайера.
Поместите колбу на шейкер при 225 об/мин, чтобы инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 16-18 часов. Затем перенесите 20 миллилитров инкубационой культуры в четырехлитровую колбу, наполненную одним литром LB-ампициллина. Встряхните при 225 об/мин при 37 градусах по Цельсию.
Каждый час, привлечь один миллилитр культуры в кювет для измерения оптической плотности на 600 нанометров на фотометре. По мере увеличения оптической плотности культуры около 0,5, увеличить частоту измерений каждые 15 минут, пока OD600 не достигнет 0,5. Затем перенесите четырехлитровую колбу в корзину со льдом.
Закружить колбу в ледяной ванне, чтобы снизить температуру культуры. Перенесите четырехлитровую колбу в инкубатор при 17 градусах Цельсия и 180 об/мин. Продолжайте следить за OD600 каждые 20 минут.
При 0,7 OD600 добавьте растворы для гексагидрата IPTG и аммония железа сульфат гексагидрата, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 миллимолара и 10 миллиграммов на литр, соответственно. Встряхните культуру при 180 об/мин и 17 градусах по Цельсию в течение 18 часов. После инкубации поместите культурную колбу во льду на две минуты.
Урожай один миллилитр индуцированных клеток в 1,5-миллилитровый полипропилен микроцентрифуг трубки для анализа SDS-PAGE. Далее, залить бактериальной культуры в бутылки, 500 миллилитров каждую бутылку, для центрифугации. Пеллет культуры при четырех градусах по Цельсию и 3000 раз г в течение 20 минут.
Декант супернатантов. Пипетку, чтобы повторно гранулы, каждый в 12,5 миллилитров холодного PBS, и объединить каждые два повторного незаменимия в 50-миллилитровой конической трубки. Пеллет клетки снова, как и раньше.
Затем отбросьте супернатанты и используйте пипетку, чтобы добавить 10 миллилитров буфера лиза в каждую трубку для повторного перерасхода клеток. После sonicating трубок с индуцированными клетками, залить бактериальный лизат в предварительно охлажденной поликарбонат бутылки. Центрифуга в течение 60 минут при 120 000 раз г и четыре градуса Цельсия, и залить супернатант холодной 50-миллилитровой конической трубки.
После подготовки прибора FPLC с никель-заряженной смолой колонки, загрузите образец в столбец на 0,15 миллилитров в минуту. Вымойте колонку с 20 миллилитров никеля буфера на 20-миллимолярный имидазол. Сохраните стирку в 50-миллилитровой трубке для анализа.
Затем вымойте столбец 15 миллилитров буфера никеля на 125-миллимолярный имидазол. Соберите элюцион в 19 фракций по 0,8 миллилитров каждый. Вымойте столбец снова с 15 миллилитров 100%nickel буфер B, и собрать дополнительные 75 фракций по 0,2 миллилитров каждый.
Продолжить анализ собранных фракций на 12%SDS-PAGE гели, чтобы подтвердить наличие PCD. Во-первых, добавьте 35 микролитров буфера реакции в 1,5-миллилитровую полипропиленовую микроцентрифугную трубку. В трубке смешайте пять микролитров пиковых хроматографических фракций и 500 нанограммов трехкилограммовой пары с суперколеной плазмидной pXba.
Поместите трубку в водяную баню при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После приготовления агарозного геля в соответствии с рукописью, добавьте 30 микролитров каждой реакции в скважины в геле. Электрофорез на 10 вольт в сантиметр при температуре окружающей среды в течение примерно одного часа.
Теперь, оранжевый краситель G достиг конца геля. Немедленно используйте сканер флуоресценции для изображения бромистого сигнала этидия геля. С функцией интенсивности и размера пикселя изображения, определить объем пикселей различных видов ДНК, таких как supercoiled, линейные и nicked круги.
Чтобы определить процент каждого вида ДНК, разделите объем пикселей одного вида ДНК на общий объем пикселей для всех отдельных видов. Анализ SDS-PAGE показывает, что второй пик элюции содержит минимальное белковое загрязнение, которое представляет собой почти чистый гетенодимер PCD и минимальное до необнаруживаемой активности нуклеазы. Таким образом, объединить эти 10 фракций от второго PCD elution в пятими миллилитровой конической трубки для дальнейшего анализа.
После очистки хроматографии размера-исключения PCD, в четырехградумной холодной комнате Цельсия, объединить в микроцентрифуг трубки соответствующий объем хлорида натрия, Tris гидрохлорид, хлорид магния, дитиотрейтол, PCA, и supercoiled плазмид pXba, чтобы сделать 5X запас. Поместите на лед 96-хорошо плоскую нижнюю пластину и перенесите 10 микролитров комбинированного 5X-раствора на скважины. Непосредственно перед анализом добавьте к каждому колодец по 10 микролитров отдельных фракций PCD SEC.
Установите считыватель пластины до внутренней температуры 37 градусов по Цельсию, и передать 96-хорошо пластины на держатель пластины. Свясть держатель пластины в инструмент, и измерить абсорбтность на 290 нанометров с 20-секундными интервалами в течение одного часа. Установите инструмент, чтобы встряхнуть пластину за пять секунд до каждого чтения.
Через час добавьте 10 микролитров стоп-раствора к каждому хорошо, чтобы прекратить реакции. Выполните гель электрофорез для фракций PCD SEC. Выберите фракции с наибольшей активностью окисления PCA, о чем свидетельствует снижение абсорбции и отсутствие наблюдаемого загрязнения нуклеазы.
Измерьте абсорбанс на 280 нанометров и рассчитайте общую концентрацию ПХД на основе абсорбанса и коэффициента вымирания. Храните выбранные фракции для длительного хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В этом эксперименте было установлено, что рекомбинантный ПХД, гетередимер гексахистидина с тегами pcaH и pcaG, был выражен в E.coli.
Гетеродимер был впервые очищен хроматографией сродства никеля. Абсорбанс показан синим цветом, а процентная концентрация буфера никеля B показана красным цветом. Поток через показывает растворимые бактериальные белки, которые не связываются с никель смолы.
Некоторые PCD eluted в присутствии 125-миллимолярского имидазола, но большинство белка eluted в 250-миллимола имидазола. Репрезентативный анализ SDS-PAGE показывает, что фракции от шага элюции были свободны от загрязняющих веществ. Агарозовый гель нуклеазы показывает загрязнение путем сравнения с отрицательным контролем без добавления белка и положительного контроля, загрязненного нуклеазой ДНК.
Квантитация различных видов ДНК, наблюдаемых в анализе нуклеазы агарозного геля, показывает, что фракции от 29 до 38 имели небольшую активность нуклеазы, которые были выбраны для комбинированной, концентрированной и дальнейшей очистки SEC. Данные трех репрезентативных фракций SEC показали, что очищенный ПХД снизил абсорбцию на 290 нанометров, что указывает на окисление PCA. После этой процедуры очищенный ПХД может быть использован и оптимизирован в желаемой системе очистки кислорода.
Это определит точное количество PCD, необходимое для системы. Этот метод был использован для продления срока службы флюорофора в экспериментах по микроскопии одной молекулы, что позволило в течение более длительных периодов сбора данных. Ультрацентрифуг используется является опасным.
Убедитесь, что центрифуги должным образом сбалансированы до вращения. Бромид этидия является опасным реагентом. Избегайте контакта, нося средства индивидуальной защиты, и распоряжаться им надлежащим образом.
