当社のプロトコルは、検出可能なヌクレアーゼから解放された非常に活性なPCDを生み出し、水性酸素が汚染物質であるあらゆる溶液に使用することができます。私たちが使用する技術は複製が容易で、製品にヌクレアーゼ汚染物質が存在しないようにします。まず、pVP91A-pcaHG PCD発現プラスミドの1マイクロリットルと、市販の大腸菌BL21の20マイクロリットルをチューブに組み合わせます。
チューブをフリックして混ぜ、チューブを氷の上に5分間置きます。変換反応を継続するには、チューブを摂氏42度の水浴に30秒間置き、氷の上に2分間置きます。SOC培地を80マイクロリットル加え、225rpmと37°Cで1時間振ります。
次に、変換反応混合物をLBアンピシリン寒天に注ぎ、プレートスプレッダーを使用して混合物を広げる。蓋でプレートを覆い、16〜18時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。その後、プレートからコロニーを1つ選び、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで50マイクロリットルのLBアンピシリンを接種する。
フラスコを225rpmのシェーカーに置き、摂氏37度で16~18時間インキュベートします。次いで、インキュベート培養物20ミリリットルをLB-アンピシリン1リットルで満たされた4リットルフラスコに移す。摂氏37度で225rpmで振ります。
1時間ごとに、培養物の1ミリリットルをキュベットに引き込み、光量計で600ナノメートルで光学密度を測定する。培養光学密度が0.5近く増加するにつれて、測定の頻度を15分ごとに増加させ、OD600が0.5に達するまで。その後、4リットルフラスコを氷のビンに移します。
氷浴中のフラスコを旋回して培養温度を下げる。4リットルのフラスコを摂氏17度と180rpmのインキュベーターに移します。OD600を20分ごとに監視し続けます。
0.7 OD600で、IPTGと硫酸アンモニウムの六水和物のストック溶液を加え、それぞれ0.5ミリモルおよび1リットル当たり10ミリグラムの最終濃度に達する。180 rpm、17°Cで18時間振ります。インキュベーション後、培養フラスコを氷の中に2分間入れます。
誘導細胞を1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心分離管で1ミリリットル収穫し、SDS-PAGE分析を行います。次に、細菌培養物をボトルに注ぎ、各ボトルに500ミリリットル、遠心分離を行う。4°Cで培養し、20分間3,000グラムペレット。
上清をデカントします。ピペットはペレットを再懸濁し、それぞれ12.5ミリリットルの冷たいPBSで、2つの再懸濁液を50ミリリットルの円錐管に組み合わせます。以前のように再び細胞をペレット。
次いで、上清を捨て、ピペットを用いて各チューブに10ミリリットルのライシスバッファーを加えて細胞を再懸濁させる。誘導細胞でチューブを超音波処理した後、細菌のリゼートを冷やされたポリカーボネートボトルに注ぎます。遠心分離機は120、000回gと摂氏4度で60分間、冷たい50ミリリットルの円錐管に上清を注ぎます。
ニッケルを帯電した樹脂カラムでFPLC装置を準備した後、サンプルを1分間に0.15ミリリットルでカラムにロードします。20ミリモルイミダゾールで20ミリリットルのニッケルバッファーでカラムを洗います。分析のために50ミリリットルのチューブに洗浄を保持します。
次に、125ミリモルイミダゾールで15ミリリットルのニッケルバッファーでカラムを洗浄します。各0.8ミリリットルの19画分で溶出を収集します。100%ニッケルバッファーBの15ミリリットルで再度カラムを洗い、さらに75分の0.2ミリリットルを集めます。
PCDの存在を確認するために12%SDS-PAGEゲルで収集された分率の分析を続けます。まず、1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心分離チューブに35マイクロリットルの反応バッファーを加えます。チューブ内で、ピーククロマトグラフィー画の5マイクロリットルと3キロベースペアのスーパーコイルプラスミドpXbaの500ナノグラムを組み合わせます。
チューブを摂氏37度の水浴に1時間置きます。原稿に従ってアガロースゲルを調製した後、ゲル内のウェルに各反応の30マイクロリットルを加える。周囲温度で10ボルト/センチメートルで約1時間のエレクトロフォレス。
オレンジ色のG染料がゲルの終わりに達しました。すぐに、蛍光スキャナーを使用して、ゲルの臭化エチジウム信号を画像化します。強度と画像ピクセルサイズの機能を使用して、スーパーコイル、リニア、ニックされた円などのさまざまなDNA種のピクセル体積を決定します。
各DNA種の割合を求めるには、単一のDNA種のピクセル量を、個々の種の総ピクセル量で割ります。SDS-PAGE分析は、第2の溶出ピークは、ほぼ純粋なPCDヘテロダイマーを表し、検出不可能なヌクレアーゼ活性を最小限にする最小限のタンパク質汚染を含み示しています。したがって、さらに分析するために、2番目のPCD溶出からこれらの10画分を5ミリリットルの円錐管に組み合わせます。
PCDのサイズ排除クロマトグラフィー精製後、摂氏4度の冷たい部屋で、マイクロ遠心チューブに適切な塩化ナトリウム、塩酸塩トリス塩酸塩、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール、PCA、およびスーパーコイルプラスミドpXbaを組み合わせて5倍のストックを作ります。氷の上に96ウェルの平底プレートを置き、組み合わせた5X溶液の10マイクロリットルを井戸に移します。分析の直前に、個々のPCD SEC画分の各ウェル10マイクロリットルに加えます。
プレートリーダーを37°Cの内部温度に設定し、96ウェルプレートをプレートホルダーに移します。プレートホルダーを機器に引き込み、20秒間隔で290ナノメートルで吸光度を1時間測定します。各読み取りの5秒前にプレートを振るように計器を設定します。
1時間後、各ウェルに10マイクロリットルの停止溶液を加えて反応を終了します。PCD SEC画分に対してゲル電気泳動を行います。吸収度の低下とヌクレアーゼ汚染の観察がない場合に示される、PCAの酸化活性が最も多い画分を選択します。
280ナノメートルで吸光度を測定し、吸光度と吸光係数に基づいてPCD濃度の合計を計算します。選択した分数を長期保存用にマイナス80°Cで保存します。本実験では、ヘキジスチジンタグ付きpcaHおよびpcaGのヘテロダイマーである組換えPCDが大腸菌で発現していることが分かった。
ヘテロ二級体を、ニッケル親和クロマトグラフィーにより最初に精製した。吸光度は青色で示され、ニッケル緩衝液Bのパーセント濃度は赤で示される。フロースルーは、ニッケル樹脂に結合しなかった可溶性細菌タンパク質を示す。
一部のPCDは125ミリモルイミダゾールの存在下で溶出したが、タンパク質の大部分は250ミリモルイミダゾールで溶出した。代表的なSDS-PAGE分析は、溶出ステップからの分数が汚染物質を含まないことを示している。ヌクレアーゼアッセイのアガロースゲルは、タンパク質を添加しない陰性対照とDNAヌクレアーゼで汚染された陽性対照と比較して汚染を明らかにする。
アガロースゲルヌクレアーゼアッセイで観察された様々なDNA種の定量は、29〜38の分数が組み合わされ、濃縮され、SECによってさらに精製されるように選択されたヌクレアーゼ活性がほとんどなかったことを示している。この手順に従って、精製されたPCDを使用し、所望の酸素清掃システムで最適化することができる。
これにより、システムに必要な正確な PCD 量が決まります。この技術は、単一分子顕微鏡実験で蛍光体の寿命を延ばすために使用され、データ収集の期間が長くなっています。使用される超遠心分離機は危険です。
回転する前に、遠心分離機のバランスが適切であることを確認してください。臭化エチジウムは有害な試薬です。個人用保護具を着用して接触を避け、適切に処分してください。
