Il nostro protocollo produce PCD altamente attivo privo di nucleasi rilevabile, che può essere utilizzato in qualsiasi soluzione in cui l'ossigeno acquoso è un contaminante. Le tecniche che utilizziamo sono facili da replicare e assicurano che non siano presenti contaminanti nucleasi nel prodotto. Per iniziare, combinare un microlitro di pVP91A-pcaHG plasmide di espressione PCD e 20 microlitri di E.coli BL21 disponibile in commercio in un tubo.
Scorrere il tubo per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti. Per continuare la reazione di trasformazione, posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 secondi, quindi sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere 80 microlitri di supporti SOC e agitare a 225 giri/min e 37 gradi Celsius per un'ora.
Quindi, versare la miscela di reazione di trasformazione su un agar LB-ampicillina e utilizzare uno spargitore di piastre per stendere la miscela. Coprire la piastra con un coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Successivamente, scegli una colonia dalla piastra e inocula in 50 microlitri di LB-ampicillina in un pallone Erlenmeyer da 250 millilitri.
Posizionare il pallone su uno shaker a 225 giri/min per incubare a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Quindi, trasferire 20 millilitri della coltura incubata in un pallone da quattro litri riempito con un litro di LB-ampicillina. Agitare a 225 giri/min a 37 gradi Celsius.
Ogni ora, disegna un millilitro della coltura in una cuvetta per misurare la densità ottica a 600 nanometri su un fotometro. Man mano che la densità ottica della coltura aumenta vicino a 0,5, aumentare la frequenza delle misurazioni ogni 15 minuti, fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5. Quindi, trasferire il pallone da quattro litri in un bidone di ghiaccio.
Ruotare il pallone nel bagno di ghiaccio per ridurre la temperatura di coltura. Trasferire il pallone da quattro litri in un'incubatrice a 17 gradi Celsius e 180 giri/min. Continuare a monitorare l'OD600 ogni 20 minuti.
A 0,7 OD600, aggiungere soluzioni di stock esaidrato di solfato di ferro IPTG e ammonio per raggiungere una concentrazione finale rispettivamente di 0,5 millimolare e 10 milligrammi per litro. Scuoti la cultura a 180 giri/min e 17 gradi Celsius per 18 ore. Dopo l'incubazione, mettere il pallone di coltura nel ghiaccio per due minuti.
Raccogliere un millilitro delle cellule indotte in un tubo di microcentrifugo in polipropilene da 1,5 millilitri per l'analisi SDS-PAGE. Quindi, versare la coltura batterica in bottiglie, 500 millilitri per bottiglia, per la centrifugazione. Pellet la coltura a quattro gradi Celsius e 3.000 volte g per 20 minuti.
Decantare i supernatanti. Pipetta per rimostrare i pellet, ciascuno in 12,5 millilitri di PBS freddo, e combinare ogni due resuspensioni in un tubo conico da 50 millilitri. Pellettare nuovamente le celle come in precedenza.
Quindi, scartare i supernaganti e utilizzare una pipetta per aggiungere 10 millilitri di tampone di lisi in ogni tubo per rimescolare le cellule. Dopo aver sonicato i tubi con cellule indotte, versare il lysate batterico in una bottiglia di policarbonato pre-refrigerata. Centrifugare per 60 minuti a 120.000 volte g e quattro gradi Celsius e versare il supernatante in un tubo conico freddo da 50 millilitri.
Dopo aver preparato lo strumento FPLC con la colonna di resina caricata al nichel, caricare il campione sulla colonna a 0,15 millilitri al minuto. Lavare la colonna con 20 millilitri di tampone di nichel a imidazolo da 20 millimolare. Conservare il lavaggio in un tubo da 50 millilitri per l'analisi.
Quindi, lavare la colonna con 15 millilitri di tampone di nichel a imidazolo da 125 millimolare. Raccogliere l'eluizione in 19 frazioni di 0,8 millilitri ciascuna. Lavare nuovamente la colonna con 15 millilitri di tampone di nichel B al 100% e raccogliere altre 75 frazioni di 0,2 millilitri ciascuna.
Continuare con l'analisi delle frazioni raccolte su gel 12%SDS-PAGE per confermare la presenza di PCD. In primo luogo, aggiungere 35 microlitri di tampone di reazione a un tubo di microcentrifugo in polipropilene da 1,5 millilitri. Nel tubo, unire cinque microlitri delle frazioni di cromatografia di picco e 500 nanogrammi di coppia di tre chili di pXba plasmide supercoiled.
Posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver preparato il gel di agarosio secondo il manoscritto, aggiungere 30 microlitri di ogni reazione nei pozzi nel gel. Elettroforrese a 10 volt per centimetro a temperatura ambiente per circa un'ora.
Ora, il colorante G arancione ha raggiunto la fine del gel. Immediatamente, utilizzare uno scanner a fluorescenza per immaginere il segnale di bromuro di etidio del gel. Con la funzione dell'intensità e della dimensione dei pixel dell'immagine, determinare il volume in pixel delle varie specie di DNA, come i cerchi supercoiled, lineari e nicked.
Per determinare la percentuale di ogni specie di DNA, dividere il volume di pixel di una singola specie di DNA per il volume totale di pixel per tutte le singole specie. L'analisi SDS-PAGE mostra che il secondo picco di eluizione contiene una contaminazione proteica minima, che rappresenta un eterodimero PCD quasi puro e un'attività nucleasi minima o non rilevabile. Pertanto, combinare queste 10 frazioni dalla seconda eluizione PCD in un tubo conico a cinque millilitri per ulteriori analisi.
Dopo la purificazione cromatografica a esclusione di dimensioni del PCD, in una stanza fredda di quattro gradi Celsius, combinare in un tubo di microcentrifugo un volume appropriato di cloruro di sodio, cloridrato di Tris, cloruro di magnesio, ditiotreitolo, PCA e pXba plasmide supercoiled per fare uno stock 5X. Posizionare una piastra a fondo piatto da 96 poggianti sul ghiaccio e trasferire 10 microlitri della soluzione 5X combinata ai pozzi. Immediatamente prima dell'analisi, aggiungere ad ogni pozzo 10 microlitri delle singole frazioni PCD SEC.
Impostare il lettore di piastre su una temperatura interna di 37 gradi Celsius e trasferire la piastra da 96 pozzi sul supporto della piastra. Ritrarre il supporto della piastra nello strumento e misurare l'assorbanza a 290 nanometri a intervalli di 20 secondi per un'ora. Impostare lo strumento per scuotere la piastra cinque secondi prima di ogni lettura.
Dopo un'ora, aggiungere 10 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzo per terminare le reazioni. Eseguire l'elettroforesi del gel per le frazioni PCD SEC. Selezionare le frazioni con la maggior parte dell'attività di ossidazione pca, indicata da una diminuzione dell'assorbanza e da nessuna contaminazione da nucleasi osservata.
Misurare l'assorbanza a 280 nanometri e calcolare la concentrazione totale di PCD in base all'assorbanza e al coefficiente di estinzione. Conservare le frazioni selezionate per l'archiviazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius. In questo esperimento, è stato scoperto che il PCD ricombinante, un eterodimero di esahistidina taggato pcaH e pcaG, è stato espresso in E.coli.
L'eterodimero fu purificato per la prima volta dalla cromatografia ad affinità al nichel. L'assorbanza è mostrata in blu, e la concentrazione percentuale di nichel buffer B è mostrata in rosso. Il flusso-through mostra le proteine batteriche solubili che non si legavano alla resina di nichel.
Alcuni PCD eluivano in presenza di imidazolo 125 millimolare, ma la maggior parte della proteina eluizzava nell'imidazolo 250 millimolare. L'analisi rappresentativa SDS-PAGE indica che le frazioni della fase di eluizione erano libere da contaminanti. Il gel di agarosio del test della nucleasi rivela contaminazione confrontandolo con il controllo negativo senza proteine aggiunte e un controllo positivo contaminato da una nucleasi del DNA.
La quantificazione delle varie specie di DNA osservate nel saggio di nucleasi del gel di agarosio mostra che le frazioni da 29 a 38 avevano poca attività di nucleasi, che sono state scelte per essere combinate, concentrate e ulteriormente purificate dalla SEC. Seguendo questa procedura, il PCD purificato può essere utilizzato e ottimizzato nel sistema di scavenging dell'ossigeno desiderato.
Questo determinerà la quantità esatta di PCD necessaria per il sistema. Questa tecnica è stata utilizzata per prolungare la durata del fluoroforo negli esperimenti di microscopia a singola molecola, che ha permesso periodi più lunghi di raccolta dei dati. L'ultracentrifugo utilizzato è pericoloso.
Assicurarsi che le centrifughe siano correttamente bilanciate prima della filatura. Il bromuro di etidio è un reagente pericoloso. Evitare il contatto indossando dispositivi di protezione individuale e smaltirli in modo appropriato.
