Protokolümüz, sulu oksijenin kirletici olduğu herhangi bir çözeltide kullanılabilen saptanabilir nükleaziçermeyen son derece aktif PCD verir. Kullandığımız teknikleri çoğaltmak kolaydır ve üründe nükleaz kirletici maddelerin bulunmamasını sağlar. Başlamak için, pVP91A-pcaHG IFADE plazmid bir mikrolitre ve bir tüp ticari olarak kullanılabilir E.coli BL21 20 mikrolitre birleştirir.
Karıştırmak için tüpü hafifçe çırpın ve tüpü beş dakika buza yerleştirin. Dönüşüm reaksiyonuna devam etmek için tüpü 42 derecede 30 saniye su banyosuna koyun, sonra iki dakika buza koyun. 80 mikrolitre SOC medya ekleyin ve bir saat boyunca 225 rpm ve 37 santigrat derecede sallayın.
Daha sonra, bir LB-ampicillin agar üzerine dönüşüm reaksiyon karışımı dökün ve karışımı yaymak için bir tabak yayıcı kullanın. Bir kapak ile plaka kapağı ve 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece plaka kuluçka. Bundan sonra, plaka bir koloni seçin ve 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde LB-ampisilin 50 mikrolitre aşılamak.
16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka için 225 rpm bir shaker üzerinde şişe yerleştirin. Sonra, bir litre LB-ampisilin ile dolu dört litrelik bir şişeye kuluçka kültürünün 20 mililitresini aktarın. 37 santigrat derecede 225 rpm'de salla.
Her saat, bir fotometre üzerinde 600 nanometre optik yoğunluğunu ölçmek için bir cuvette içine kültür bir mililitre çizin. Kültür optik yoğunluğu 0,5'e yaklaştıkça, OD600 0,5'e ulaşana kadar ölçüm sıklığını her 15 dakikada bir artırın. Sonra, dört litrelik şişeyi bir buz kutusuna aktarın.
Kültür sıcaklığını azaltmak için şişeyi buz banyosunda döndürün. Dört litrelik şişeyi 17 santigrat derece ve 180 rpm'de bir kuvöze aktarın. OD600'ü her 20 dakikada bir izlemeye devam edin.
0.7 OD600 anda, iptg ve amonyum demir sülfat heksahidrat stok çözeltileri litre başına 0,5 milimolar ve 10 miligram son konsantrasyonulaşmak için ekleyin, sırasıyla. 18 saat boyunca 180 rpm ve 17 santigrat derece de kültür shake. Kuluçkadan sonra, kültür şişesini iki dakika buza koyun.
SDS-PAGE analizi için 1.5 mililitrelik polipropilen mikrosantrifüj tüp içinde indüklenen hücrelerin bir mililitre hasat. Sonra, santrifüj için şişeler, 500 mililitre her şişe içine bakteri kültürü dökün. Pelet kültürü 4 santigrat derece ve 3, 000 kez 20 dakika g.
Süpernatantları decant. Pipet, her biri 12,5 mililitre soğuk PBS'de bulunan peletleri yeniden askıya almak ve her iki süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpte birleştirmek için. Daha önce olduğu gibi hücreleri tekrar pelet.
Daha sonra, supernatants atın ve hücreleri yeniden askıya almak için her tüp içinde lysis tampon 10 mililitre eklemek için bir pipet kullanın. Tüpleri indüklenen hücrelerle sonicating sonra, önceden soğutulmuş polikarbonat şişe içine bakteriyel lizat dökün. 120, 000 kez g ve dört santigrat derece 60 dakika santrifüj ve soğuk bir 50 mililitrekonik tüp için supernatant dökün.
FPLC cihazıni nikel yüklü reçine sütunu ile hazırladıktan sonra, numuneyi dakikada 0,15 mililitre lik kolona yükleyin. 20-milimolar imidazol de nikel tampon 20 mililitre ile sütun yıkayın. Analiz için 50 mililitrelik bir tüp içinde yıkama tutun.
Daha sonra, 125 milimolar imidazol de nikel tampon 15 mililitre ile sütun yıkayın. Her biri 0,8 mililitre 19 kesirlerde elüsyonu toplayın. Sütunu %100 nikel tampon B'nin 15 mililitresiyle tekrar yıkayın ve her biri 0,2 mililitrelik ek 75 kesir toplayın.
PCD varlığını doğrulamak için% 12 SDS-PAGE jelleri üzerinde toplanan kesirlerin analizi ile devam edin. İlk olarak, 1.5 mililitrelik polipropilen mikrosantrifüj tüpüne 35 mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin. Tüpte, pik kromatografi fraksiyonları beş mikrolitre ve üç kilobase çifti 500 nanogram supercoiled plazmid pXba birleştirir.
Bir saat için 37 santigrat derece bir su banyosu tüp yerleştirin. El yazmasına göre agarose jel hazırladıktan sonra, jel kuyular içine her reaksiyon 30 mikrolitre ekleyin. Yaklaşık bir saat boyunca ortam sıcaklığında 10 volt santimetre de elektrofore.
Turuncu G boyası jelin ucuna ulaştı. Hemen, jel ethidyum bromür sinyali görüntü için bir floresan tarayıcı kullanın. Yoğunluk ve görüntü piksel boyutu işlevi ile, çeşitli DNA türlerinin piksel hacmini belirleyin, örneğin süper kıvrılmış, doğrusal ve çentikli daireler.
Her DNA türünün yüzdesini belirlemek için, tek bir DNA türünün piksel hacmini tüm tek tek türlerin toplam piksel hacmine bölün. SDS-PAGE analizi, ikinci elüsyon zirvesinin neredeyse saf PCD heterodimer ve tespit edilemeyen nükleaz aktivitesini en az temsil eden minimal protein kontaminasyonu içerdiğini göstermektedir. Böylece, daha fazla analiz için beş mililitrelik konik tüp ikinci PCD elution bu 10 fraksiyonları birleştirin.
PCD boyut dışlama kromatografi saflaştırma sonra, dört derece santigrat soğuk odada, sodyum klorür, Tris hidroklorür, magnezyum klorür, dithiothreitol, PCA ve supercoiled plazmid pXba bir mikrosantrifüj tüp uygun hacimde bir araya 5X stok yapmak. Buz üzerine 96 kuyuluk düz taban plakası yerleştirin ve kombine 5X çözeltisinin 10 mikrolitresini kuyulara aktarın. Analizden hemen önce, her bir pcd SEC fraksiyonları her iyi 10 mikrolitre ekleyin.
Plaka okuyucuyu 37 santigrat derecelik bir iç sıcaklığa ayarlayın ve 96 kuyulu plakayı plaka tutucuya aktarın. Plaka tutucuyu aletin içine geri alın ve 20 saniyelik aralıklarla 290 nanometrede bir saat boyunca emiciliği ölçün. Aleti her okumadan beş saniye önce plakayı sallamaya ayarlayın.
Bir saat sonra, reaksiyonları sonlandırmak için her kuyuya 10 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin. PCD SEC fraksiyonları için jel elektroforez gerçekleştirin. En fazla PCA oksidasyon aktivitesine sahip kesirleri seçin, azalmış absorbans ve gözlenen nükleaz kontaminasyonu ile gösterilir.
Emiciliği 280 nanometre olarak ölçün ve emicilik ve yok olma katsayısına göre toplam PCD konsantrasyonu hesaplayın. Uzun süreli depolama için seçili kesirleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu deneyde, heksahistidin etiketli pcaH ve pcaG heterodimer rekombinant PCD, E.coli ifade bulunmuştur.
Heterodimer ilk nikel afinite kromatografi silerek saflaştırılmıştı. Emicilik mavi ile gösterilir ve nikel tampon U'nun yüzde konsantrasyonu kırmızı renkte gösterilir. Akış, nikel rezorine bağlanmayan çözünür bakteriproteinlerini gösterir.
Bazı PCD 125-milimolar imidazol varlığında eluted, ancak proteinçoğunluğu 250-milimolar imidazol eluted. Temsilci SDS-PAGE analizi, elüsyon adımındaki kesirlerin kirletici madde içermez. Nükleaz testinin Agarose jeli, ilave protein ve DNA nükleazı ile kontamine olmuş pozitif kontrol olmadan negatif kontrol ile karşılaştırılarak kontaminasyonu ortaya çıkarır.
Agarose jel nükleaz testinde gözlenen çeşitli DNA türlerinin nicelliği, 29 ile 38 arasında kesirlerin, birleştirilmesi, konsantre edilmesi ve SEC tarafından daha da saflaştırılması için seçilen küçük nükleaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü takiben, saflaştırılmış PCD kullanılabilir ve istenilen oksijen atma sisteminde optimize.
Bu, sistem için gereken TAM PCD miktarını belirler. Bu teknik, tek moleküllü mikroskopi deneylerinde florofor ömrünü uzatmak için kullanılmıştır, bu da daha uzun süre veri toplamasına olanak sağlamıştır. Kullanılan ultracentrifuge tehlikelidir.
Dönmeden önce santrifüjlerin düzgün bir şekilde dengelendiğinden emin olun. Ethidium bromür tehlikeli bir reaktiftir. Kişisel koruyucu ekipman giyerek temastan kaçının ve uygun şekilde atın.
