Nosso protocolo produz PCD altamente ativo livre de nuclease detectável, que pode ser usado em qualquer solução onde o oxigênio aquoso é um contaminante. As técnicas que usamos são fáceis de replicar e garantem que não haja contaminantes nuclease no produto. Para começar, combine um microliter de expressão pVP91A-pcaHG PCD plasmid e 20 microliters de E.coli BL21 comercialmente disponível em um tubo.
Flick o tubo para misturar, e coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Para continuar a reação de transformação, coloque o tubo em um banho de água a 42 graus Celsius por 30 segundos, depois no gelo por dois minutos. Adicione 80 microliters de mídia SOC, e agite a 225 rpm e 37 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, despeje a mistura de reação de transformação em um ágar LB-ampicillin, e use um espalhador de placas para espalhar a mistura. Cubra a placa com uma tampa e incubar a placa a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. Depois disso, escolha uma colônia da placa, e inocula em 50 microlitrais de LB-ampicillin em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros.
Coloque o frasco em um shaker a 225 rpm para incubar a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. Em seguida, transfira 20 mililitros da cultura incubada para um frasco de quatro litros cheio de um litro de LB-ampicillin. Agite a 225 rpm a 37 graus Celsius.
A cada hora, desenhe um mililitro da cultura em um cuvette para medir a densidade óptica em 600 nanômetros em um fotômetro. À medida que a densidade óptica da cultura aumenta perto de 0,5, aumente a frequência de medições a cada 15 minutos, até que o OD600 atinja 0,5. Então, transfira o frasco de quatro litros para uma caixa de gelo.
Gire o frasco no banho de gelo para reduzir a temperatura da cultura. Transfira o frasco de quatro litros para uma incubadora a 17 graus Celsius e 180 rpm. Continue monitorando o OD600 a cada 20 minutos.
A 0,7 OD600, adicione soluções de estoque de hexahidrato de ferro IPTG e amônio para atingir uma concentração final de 0,5 milimilitro e 10 miligramas por litro, respectivamente. Agitar a cultura a 180 rpm e 17 graus Celsius por 18 horas. Após a incubação, coloque o frasco de cultura no gelo por dois minutos.
Colher um mililitro das células induzidas em um tubo de microcentrifuge de polipropileno de 1,5 mililitro para análise de SDS-PAGE. Em seguida, despeje a cultura bacteriana em garrafas, 500 mililitros cada garrafa, para centrifugação. Pelota a cultura a quatro graus Celsius e 3.000 vezes g por 20 minutos.
Decantar os supernantes. Pipeta para resuspensar as pelotas, cada uma em 12,5 mililitros de PBS frio, e combinar a cada duas resuspensões em um tubo cônico de 50 mililitros. Pelotar as células novamente como anteriormente.
Em seguida, descarte os supernacantes e use uma pipeta para adicionar 10 mililitros de tampão de lise em cada tubo para resuspensar as células. Depois de sonicar os tubos com células induzidas, despeje o linfit bacteriano em um frasco de policarbonato pré-refrigerado. Centrífuga por 60 minutos a 120.000 vezes g e quatro graus Celsius, e despeje o supernatante a um tubo cônico frio de 50 mililitros.
Depois de preparar o instrumento FPLC com a coluna de resina carregada de níquel, carregue a amostra para a coluna a 0,15 mililitros por minuto. Lave a coluna com 20 mililitros de tampão de níquel a imidazol de 20 mililitros. Retenha a lavagem em um tubo de 50 mililitros para análise.
Em seguida, lave a coluna com 15 mililitros de tampão de níquel a 125 mililitros imidazol. Colete a elução em 19 frações de 0,8 mililitros cada. Lave a coluna novamente com 15 mililitros de 100% de níquel tampão B, e colete 75 frações adicionais de 0,2 mililitros cada.
Continue com a análise das frações coletadas em géis 12%SDS-PAGE para confirmar a presença de PCD. Primeiro, adicione 35 microliters de tampão de reação a um tubo de microcentrifuge de polipropileno de 1,5 mililitro. No tubo, combine cinco microlitadores das frações de cromatografia de pico e 500 nanogramas de três quilogramas de par de plasmídeos supervilecidos pXba.
Coloque o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius durante uma hora. Depois de preparar gel de ágarose de acordo com o manuscrito, adicione 30 microliters de cada reação em poços no gel. Eletroforese a 10 volts por centímetro a temperatura ambiente por aproximadamente uma hora.
Agora, o corante G laranja chegou ao fim do gel. Imediatamente, use um scanner de fluorescência para imaginar o sinal de brometo de ethidium do gel. Com a função da intensidade e tamanho do pixel de imagem, determine o volume de pixels das várias espécies de DNA, como círculos supercoados, lineares e cortados.
Para determinar a porcentagem de cada espécie de DNA, divida o volume de pixels de uma única espécie de DNA pelo volume total de pixels para todas as espécies individuais. A análise SDS-PAGE mostra que o segundo pico de elução contém contaminação mínima de proteína, o que representa heterodimer PCD quase puro e atividade nuclease mínima e indetectável. Assim, misture estas 10 frações da segunda eluição pcd em um tubo cônico de cinco mililitros para análise posterior.
Após a purificação cromatografia de exclusão de tamanho do PCD, em uma sala fria de quatro graus Celsius, combine em um tubo de microcentrifuse volume apropriado de cloreto de sódio, cloridrato tris, cloreto de magnésio, dithiothreitol, PCA, e pXba plasmid supercoiled para fazer um estoque de 5X. Coloque uma placa de fundo plano de 96 poços no gelo e transfira 10 microliters da solução 5X combinada para os poços. Imediatamente antes da análise, adicione a cada poço 10 microliters das frações individuais da SEC PCD.
Coloque o leitor de placas a uma temperatura interna de 37 graus Celsius e transfira a placa de 96 poços para o suporte da placa. Retire o suporte da placa no instrumento e meça a absorvância em 290 nanômetros em intervalos de 20 segundos durante uma hora. Coloque o instrumento para agitar a placa cinco segundos antes de cada leitura.
Após uma hora, adicione 10 microliters de solução stop a cada poço para encerrar as reações. Realize a eletroforese de gel para as frações PCD SEC. Selecione frações com maior atividade de oxidação pca, indicadas pela diminuição da absorvância e sem contaminação por nuclease observada.
Meça a absorvância em 280 nanômetros e calcule a concentração total de PCD com base na absorção e no coeficiente de extinção. Armazene as frações selecionadas para armazenamento a longo prazo a menos 80 graus Celsius. Neste experimento, verificou-se que o PCD recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, foi expresso em E.coli.
O heterodimer foi purificado pela primeira vez por cromatografia de afinidade de níquel. A absorvância é mostrada em azul, e a concentração percentual de tampão de níquel B é mostrada em vermelho. O fluxo mostra as proteínas bacterianas solúveis que não se ligam à resina de níquel.
Alguns PCD eluiram na presença de imidazol 125 milimiliar, mas a maioria da proteína eluiudiou em imidazol de 250 milimolares. A análise representativa da SDS-PAGE indica que as frações da etapa de elução estavam livres de contaminantes. Gel agarose de ensaio nuclease revela contaminação através da comparação com o controle negativo sem proteína adicionada e um controle positivo contaminado com uma nuclease de DNA.
A quantitação das várias espécies de DNA observadas no ensaio de gel de agarose mostra que as frações 29 a 38 tinham pouca atividade nuclease, que foram escolhidas para serem combinadas, concentradas e ainda purificadas pela SEC. Dados de três frações representativas da SEC mostraram que o PCD purificado reduziu a absorção em 290 nanômetros, indicando oxidação de PCA. Após este procedimento, o PCD purificado pode ser usado e otimizado no sistema de limpeza de oxigênio desejado.
Isso determinará a quantidade exata de PCD necessária para o sistema. Esta técnica tem sido usada para prolongar a vida fluorófora em experimentos de microscopia de molécula única, o que permitiu por períodos mais longos de coleta de dados. O ultracentrifuge usado é perigoso.
Certifique-se de que as centrífugas estão adequadamente equilibradas antes de girar. Brometo de ethidium é um reagente perigoso. Evite o contato usando equipamentos de proteção individual e descarte-o adequadamente.
