Оптические методы, такие как оптогенетика, могут обеспечить точную модуляцию клеточных молекулярных сигналов. Наш протокол продемонстрировал устные оптические манипуляции молекулами клеточного сигнала с помощью фемтосекундной лазерной стимуляции. Советив наш фемтосекундный лазер в конфокальный микроскоп, наша техника может обеспечить одноклеточную или субклеточную операцию с помощью фемтосекундной лазерной стимуляции и молекулярно-динамического мониторинга в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии.
Этот метод может быть применен к любым флуоресцентным системам микроскопии путем соединения фемтосекундного лазера в систему надлежащим образом. Для тех, кто пытается наш метод в первый раз, пожалуйста, следуйте отдельным инструкциям лазерного объекта или обратиться за руководством к профессионалам при эксплуатации лаборатории фемтосекундный лазерный источник. Для начала включите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп.
Используйте светоотражающие зеркала, чтобы направить фемтосекундный лазерный луч через механический затвор. Затем установите реле телескоп, состоящий из пары линз для расширения ширины луча передачи. Это должно соответствовать задней диафрагме цели.
Теперь, направить отражающие зеркала, чтобы выровнять расширенный луч в микроскоп. Отрегулируйте два отражающих зеркала, указанные здесь, чтобы настроить фокус фемтосекундного лазера к центру поля зрения. Наконец, измерьте и настройте лазеры, описанные в сопроводительном текстовом протоколе.
Культурные клетки Hela с использованием стандартных методов. Когда вы будете готовы к проведению эксперимента, трансфект клеток с ERK2-GFP, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и фемтосекундный лазер.
Убедитесь, что затвор лазера закрыт. Затем откройте программное обеспечение микроскопа. Установите лазер возбуждения на 488 нанометров и установите его уровень мощности на уровне 0,1 милливатт.
Установите размер изображения как 512 на 512 пикселей, а время интервала каждого пикселя как 2,4 микросекунды. Затем установите интервал между двумя кадрами за шесть секунд, чтобы свести к минимуму отбеливание фотографий и повреждение фото для ячеек. Кроме того, установите общий объем кадров изображения на уровне около 300 кадров, чтобы обеспечить около 30 минут непрерывной микроскопии в индивидуальном эксперименте.
Возьмите блюдо, содержащее клетки Hela, трансфицированные ERK2-GFP из инкубатора, и положите блюдо на сцену микроскопа. В программном обеспечении, начать быстрый режим сканирования, и настроить цель приобрести четкие флуоресцентные изображения клеток. Затем прекратите быстрое сканирование и переключитесь в режим ярко-полевых изображений с помощью камеры CCD.
Откройте затвор и отрегулируйте расстояние между двумя линзами реле телескопа, чтобы гарантировать, что диаметр фемтосекундного лазерного фокуса составляет около двух микрон. Затем закройте затвор, чтобы завершить регулировку. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 15 до 40 милливатт для лазера 810 нанометров, или от 20 до 60 милливатт для 1040 нанометрового лазера.
Затем установите время открытия затвора на 05-0,2 секунды. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, которая сильно выражает ERK2-GFP. После того, как найдено, переместить этап для того, чтобы локализовать цитозол области выбранной целевой ячейки, так что он находится в центре поля зрения, когда под ярким полем изображения.
После того, как по центру, нажмите на кнопку запуска, чтобы начать непрерывную визуализацию. Откройте затвор в любой предопределенный временной интервал, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию в целевую ячейку. По завершения процесса визуализации сохраните данные изображений для дальнейшего анализа.
Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 15 до 40 милливатт и 810 нанометров и от 20 до 60 милливатт и 1040 нанометров в образце. Затем возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицированные ERK2-GFP из инкубатора, и поместите его на сцену микроскопа. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, хорошо выражаю электронную ERK2-GFP.
Затем установите процесс конфокальной визуализации и определите специальную рамку сканирования в качестве каркаса стимуляции в процессе визуализации. Определите параметр каркаса стимуляции. Установите область сканирования от двух на два-три на три квадратных микрона в области цитозола близко к ядру в целевой клетке.
Установите общее время сканирования на 0,1-0,2 секунды. Установите интервал между двумя кадрами на шесть секунд и установите общий объем изображений на уровне около 300 кадров, чтобы обеспечить около 30 минут непрерывной микроскопии. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.
Синхронизировать затвор фемтосекундного лазера с конфокального сканирования в соответствии с предопределенной области стимуляции фото, которая открыта только тогда, когда лазерное сканирование падает в рамке стимуляции. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать процесс непрерывной микроскопии. Для наблюдения за митохондриальной морфологической динамикой, трансфектные клетки Гела с Мито-GFP флуоресцентно указывают митохондрии, или базы с мито-cpYFP для наблюдения митофлашей.
После трансфекции включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт. Затем включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Установите лазер возбуждения на 488 нанометров.
Затем установите уровень мощности 488 нанометрового лазера на уровне 0,1 милливатта. Кроме того, установите размер изображения до 512 на 512 пикселей, а общее время изображения каждого кадра до 2,2 секунды. Затем установите интервал между двумя кадрами на ноль секунд и общий объем кадров изображения, как 200 кадров, чтобы обеспечить около 440 секунд непрерывной микроскопии в индивидуальном эксперименте.
Возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицированные митоХондриальной GFP или митохондриальной мишенью круговой желтый флуоресцентный белок из инкубатора и положить блюдо на стадии микроскопа. Проверьте состояние фемтосекундного лазера, чтобы убедиться, что фокус фемтосекундного лазера находится в центре поля зрения. Затем установите эталонную стрелку в центре флуоресцентного окна изображения, чтобы указать положение фокуса.
Затем установите мощность фемтосекундного лазера на уровне от 5 до 30 милливатт с лазером на 810 нанометров и от 10 до 40 милливатт для лазера на 1040 нанометров. Установите время открытия затвора на 05-0,1 секунды. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую клетку, которая хорошо выражает мито GFP или митохондриальной целевой круговой желтый флуоресцентный белок.
Выберите один митохондрион случайным образом в целевой клетке в качестве экспериментального субъекта. Затем переместите стадию микроскопа, чтобы локализовать митохондриальную трубчатую структуру цели в центре поля зрения в режиме быстрого сканирования, о чем свидетельствует эталонная стрелка. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать непрерывную визуализацию.
Наконец, откройте затвор в любое заранее выясняемое время, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию в целевую митохондриальную трубчатую структуру. Подождите, пока процесс визуализации будет завершен, а затем сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных. Используя метод, представленный в этом протоколе, ERK2 транслокирует в ядро после лечения короткой вспышкой фемтосекундного лазера.
ERK2-GFP флуоресценция достигает максимума после нескольких минут фемтосекундной лазерной стимуляции. Молекулы ERK2 будут дефосфорилированы после активации субстратов вниз по течению в ядре, а затем ERK2 возвращается к цитоплазме, указанной уменьшением флуоресценции ядерного GFP. ERK2 может быть активирован несколько раз с помощью нескольких фотостимуляции.
Таким образом, можно манипулировать шаблоном сигнала ERK2 именно путем контроля времени интервала между несколькими стимулами. Кроме того, ERK2 иногда может быть активирован в соседних клетках вокруг стимулировали клетки. Это наблюдение показывает, что некоторые диффузные молекулы могут быть освобождены клеткой, обработанной фемтосекундным лазером для активации ERK2 в соседних клетках.
Фосфорилирование белка ERK2 вниз по течению eIF4E может быть подтверждено индивидуализированной микроскопией иммунофторесценции. Этот результат указывает на то, что фемтосекундная лазерная стимуляция может успешно активировать сигнальный путь ERK. Митохондриальные окислительные вспышки или митофлаши являются окислительными всплесками в митохондриях, которые корень из сложной молекулярной динамики.
Реализация этой схемы стимуляции фотографий привела к успешному возбуждению митофлаша. Эта фотостимуляция также показывает разновидности митохондриальной молекулярной динамики, включая фрагментацию и восстановление митохондриальной морфологии, а также колебания митохондриального мембранного потенциала. Как и фото активированные митофлаши, эти митохондрии события имеют различную производительность с разной интенсивности власти.
Самое главное, чтобы убедиться, что фокус, размер и точность фемтосекундного лазера является свойством для стимуляции в клетках. Ближайший инфракрасный фемтосекундный лазер может быть опасным для пользователей. Следуя этому протоколу, носить надлежащую защиту, и это предотвращает лазер от распространения из оптического стола.
