Этот протокол является первым в своем роде, который применяет фотостатины на живом предимплантационном эмбрионе мыши и рассматривает использование для использования светопереключаемых препаратов на других 3D-физиологических системах. Светопереключаемые фотостатины позволяют манипулировать ростом микротрубочек в пространстве и времени и преобразовываться обратно в выключенное состояние. Непреднамеренное воздействие фотостатинов на синий свет, до эксперимента, может активировать их преждевременно.
Поэтому мы советуем работать в условиях полной темноты или красного света в любое время при подготовке образцов. В строгих темных условиях, используя только красный свет для освещения, начинают вносить запас и промежуточный рабочий раствор ПСТ-1П в сверхчистую воду. Как описано в тексте рукописи.
Затем разводят PST-1P в свежем KSOM для достижения конечной концентрации 40 M.To подготовить слайд камеры для живой визуализации, добавить 10 л PST-1P-обработанного KSOM в центр одной лунки, чтобы сформировать полусферическую каплю. Чтобы капля не испарилась, накройте ее достаточным количеством минерального масла. Затем свободно заверните приготовленное блюдо для культивирования в фольгу или поместите блюдо для культуры в непроницаемый непрозрачный контейнер в инкубаторе, чтобы обеспечить отсутствие воздействия света.
После переноса эмбрионов в каплю KSOM, обработанную PST-1P, убедитесь, что эмбрионы сгруппированы в центре капли и оседать на дно тарелки. После того, как объектив погружения подготовлен, установите слайд камеры на микроскоп внутри камерной камеры. Установите при 37 C и 5% CO2 и в полной темноте, чтобы убедиться, что все PST-1P находятся в неактивной трансконфигурации, и что эмбрионы могут опускаться на дно чашки.
Используйте факел красного света, чтобы расположить объектив в контакте со средой погружения. Затем найдите край капли среды и расположите цель непосредственно над ней. Используя режим живого сканирования и лазер 561 нм, найдите эмбрионы внутри капли.
Используйте контроллеры стадии и режим динамического сканирования, чтобы установить начальную и конечную точки для получения z-стека всего эмбриона. Отрегулируйте настройки мощности лазера максимум до 5% в соответствии с вашим сигналом. И установите цифровое смещение на максимум 0,900, в соответствии с вашим сигналом, чтобы оптимизировать внешний вид комет EB3-dTomato.
Минимизируйте фоновый шум. Установите точечное отверстие на 2 м. Разрешение пикселей 512 х 512.
А время ожидания пикселя составляет 3,15 с. И установите масштаб в 2 раза. Приобретите z-стек всего эмбриона с интервалами сечения 1 м для оценки площадей роста микротрубочек во всем организме.
Для экспериментов по отслеживанию комет EB3-dTomato откройте 3D-изображение z-стека, увеличьте масштаб в три раза. И нарисуйте прямоугольную рентабельность инвестиций вокруг конкретной субклеточной области, представляющей интерес. Затем получаем покадровое видео одной z-плоскости, используя заданные параметры, с временным интервалом 500 мс.
Чтобы активировать PST-1P, переключитесь на лазер 405 нм и получите еще один таймлапс, с лазером, установленным на 10% мощности, максимально открытым точечным отверстием, разрешением пикселей 512 на 512, временем выдержки пикселя 3,15 с, зумом в три раза, с интервалом времени 500 мс, и набором 20 кадров для получения. Сразу после активации переключитесь обратно на лазер 561 нм и повторите получение, как было продемонстрировано ранее, чтобы подтвердить потерю комет EB3-dTomato после активации PST-1P. Теперь, чтобы вернуть PST-1P обратно в его неактивное транс-состояние, включите лазер 514 нм и получите еще один покадровый интервал с заданными параметрами.
Чтобы визуализировать восстановление комет EB3-dTomato, вернитесь на лазер 561 нм и повторите сбор. У необработанных контрольных эмбрионов до освещения лазером 405 нм сигнал EB3-dTomato был высоким во всей цитоплазме клетки, за исключением ядерной области. После освещения, изменений сигнала обнаружено не было.
Указывая на то, что лазер 405 нм не вызвал фотоповреждения эмбриона или динамики микротрубочек. Во время лечения PST-1P эмбрионов 16-клеточной стадии в строгих темных условиях на 3D-изображении была обнаружена сильная экспрессия EB3-dTomato, демонстрирующая, что неактивный PST-1P не вызывает ингибирования полимеризации микротрубочек в темных условиях. До активации PST-1P покадровая визуализация одной z-плоскости подтвердила сильную экспрессию EB3-dTomato и полимеризацию микротрубочек в субклеточной области.
После активации света 405 нм в течение нескольких секунд было обнаружено снижение сигнала кометы EB3-dTomato. А восстановление сигнала было достигнуто при отключении PST-1P, с помощью 514 нм лазера. Микроэмбрионы, введенные с EB3-dTomato и инкубированные с PST-1P, показали нормальный эмбриональный потенциал, развиваясь до стадии бластоцисты.
И нормальная динамика микротрубочек во время митоза. Указание на нетоксичность активного PST-1P для эмбриона. В приобретенных покадровых фильмах маркировка EB3-dTomato появилась как кометоподобные структуры и позволила отслеживать растущие нити микротрубочек.
В обработанных PST-1P эмбрионах, содержащихся в темных условиях, отдельные кометы EB3-dTomato исходили из межфазного моста, который действует как нецентросомальный центр организации микротрубочек у раннего эмбриона мыши. T-стек показывает кометы EB3-dTomato в области межфазного моста. После активации PST-1P кометы EB3-dTomato были уменьшены у основания межфазного моста и в t-стеке.
Помните, что белый свет может активировать PST-1P преждевременно. Поэтому используйте только красные источники света для видимости. Зеленый свет также деактивирует PST-1P, поэтому, пожалуйста, избегайте использования зеленых флуоресцентных маркеров этикетки.
Этот метод был использован у дрозофил, амеб, мышей и нескольких систем in vitro для нацеливания на рост микротрубочек с целью изучения миграции клеток и формирования тканей.
