Наличие культовых модельных организмов имеет основополагающее значение для прогресса во многих областях исследований. Этот протокол, к нашим знаниям, является единственным подходом, доступным для культивирования Doliolids. Надежная технология культуры долиолида представляет собой уникальную экспериментальную модель для изучения организмов, которые важны для некоторых из наиболее продуктивных регионов океана и которые представляют собой ранних эволюционных предков позвоночных.
Этот метод уникален, поскольку он держит частицы водорослей пищи и организмов приостановлено в колонке воды без контакта со стенами контейнера, как они испытывают в природе. Этот метод культивирования может быть применен к культивированию других мелких желатиновых и ракообразных или видов планктона. Поскольку doliolids имеют сложный жизненный цикл, понимание и признание потребностей каждого этапа жизни имеет решающее значение.
Изучение жизненного цикла и как распознать и обрабатывать их занимает много практики. По нашему опыту, единственный способ узнать эту технику культивирования, чтобы увидеть его и сделать это. Несколько других участников проекта, включая Эрин Арнесон, Николас Касталейн, Наталья Лопес, Лорен Ламбойе, Бриана Пирс, Арья Родригес-Сантьяго, и Террелл Скарборо также появились кратко в этом видео.
Перед созданием и выращиванием долиолидных культур в лаборатории очистите и стерилизовайте 1,9 и 3,8 литра стеклянных банок культуры, погрузив их в раствор гидроксида калия натрия. Разрешить банки, чтобы замочить на ночь. Затем перенесите банки в раствор бисульфита натрия.
Разрешить банки, чтобы замочить на ночь. Затем тщательно промойте банки деионизированной водой. Дайте банкам высохнуть.
Для поддержания фондовых культур используйте строгие методы топорной культуры. Каждые две недели перенесите 0,5 миллилитров старой старческого культура на 25 миллилитров свежих средств роста в стерильных 55 миллилитров стеклянных трубок культуры. Чтобы подготовить большие объемы фитопланктона для кормления долиолида, перенесите четыре миллилитров фитопланктона из топорных запасов в 500 миллилитров пластиковых тканей культуры колб, содержащих 200 миллилитров средств роста, чтобы привить при разбавлении от одного до 50.
Инкубировать культуру в экологическом инкубаторе или ходить в экологической камере при 20 градусах по Цельсию с 12 до 12 часов светло-темный цикл под прохладным белым освещением света от 65 до 85 микроeinsteins на квадратный метр. Положите культуры колбы плоские, чтобы максимизировать освещение. Аккуратно вихрем культуры ежедневно.
Отправляйтесь в море. Чтобы найти долиолиды на континентальном шельфе, развернуте океанографический прибор CTD для определения водных условий, способствующих присутствию долиолид, путем профилирования температуры воды, солености и хлорофилла флуоресценции. Подтвердите состояние воды путем проведения поисковых чистых буксиров со специализированными планктонными сетями.
Кроме того, используйте систему визуализации профилирования на месте для обнаружения doliolids. Теперь оперировать винную ушу, чтобы получить CTD. Бутылки Niskin, установленные на розетке CTD, собирали морскую воду с участка, где находятся долиолиды, и на глубине, содержащей самые высокие оценки хлорофилла.
Промыть три 22-литровых ведра с морской водой и заполнить морской водой чуть более половины полной. Заполните чистый конец трески полностью морской водой и прикрепить конец трески к сети. Развертывание сети.
Опустите и поднимите сетку через колонку воды, сохраняя наклонный угол буксировки от 15 до 25 градусов и вертикальное развертывание и скорость поиска не более 15 метров в минуту. После того, как сеть на борту осторожно передачи и разделить содержимое трески конца в пластиковые ведра каждый из которых содержит поверхностную морскую воду, собранную с сайта. С помощью широкофюсовой стеклянной пипетки аккуратно смешайте содержимое стакана с пипеткой с помощью вертикальных и горизонтальных движений.
Используя указательный палец, создать капиллярный всасывания для захвата и передачи Doliolids. Захват Doliolids из смешанного фитопланктона в стакане. После добавления Doliolids, добавить культуру Родомонаса в банку до окончательной концентрации около пяти раз от 10 до 3 до 10 к четвертой клетки на миллилитр.
Проверьте цвет пищеварительного тракта Doliolids. Красный цвет определяет Doliolids активно кормления. Чтобы предотвратить Doliolids от ловушки на воздушно-водный интерфейс, полностью заполнить банки с нефильтрованной, богатой частицами морской воды, чтобы избежать головы пространстве.
Поместите кусок полиэтиленовой пленки на отверстие банки. Избегайте создания пузырьков воздуха, которые также могут повредить животных. Тщательно винт крышку на банку и осторожно инвертировать банку, чтобы определить, если пузырьки присутствуют.
Если пузырьки присутствуют, заполнить больше морской воды, чтобы удалить их. После того, как банки заполнены запечатать крышкой и протрите избыток воды с внешней стороны банки. Намонтировать каждую банку на колесо планктона, поместив банку на вертикальные металлические прутья, покрытые резиновыми трубами и между шлангом из нержавеющей стали.
Убедитесь, что задняя часть банки мягкая против резиновых труб. Отрегулируйте винт, чтобы затянуть шланг зажим вокруг банки. Разрешить банки вращаться при 0,3 об / мин, чтобы сохранить Doliolids в подвеске.
Через три дня акклиматизация к лабораторным условиям переносит от 100 до 150 миллилитров культурной воды из банки в образец контейнера и измеряет концентрацию водорослей с помощью счетчика Coulter. Основываясь на оценке концентрации водорослей, добавьте достаточно водорослей, чтобы довести концентрацию в банке культуры до 40-95 микрограммов углерода на литр. Используйте счетчик частиц для мониторинга концентраций водорослей после того, как долиолиды питались, чтобы принять решение о том, как часто и сколько водорослей добавить в культуры.
Поддержание концентрации фитопланктона в банках культуры от 40 до 95 микрограммов углерода на литр. Культивирование Doliolids требует поддержки их через их сложный жизненный цикл. Развитие личинок и озооидов и ранних медсестер.
После того, как минимум восемь тропозоидов видны на катафоре медсестры, перенесите по крайней мере четырех медсестер в новую культивную банку. Как только фарозоиды достигают трех миллиметров в размерах, уменьшить количество животных в банке. Когда phorozooids становятся больше, чем пять миллиметров и разработали гонозоидные кластеры удалить все, кроме четырех phorozooids.
Этот протокол содержит обзор подхода Dolioletta gegenbauri к сбору и выращиванию. Показатели очистки водорослей были аналогичными в концентрациях от 20 до 60 микрограммов углерода на литр и снижались по мере повышения концентрации пищи. Показатели расчистки увеличились пропорционально температурным диапазонам, поддерживающим рост D.gegenbauri.
Наблюдались темпы роста в диапазоне от 0,1 до 0,7 миллиметра в день в соответствии с температурой и наличием продовольствия. Выращивание долиолида зависит от успешного тиражирования океанических условий и удовлетворения потребностей животных на протяжении всего их сложного жизненного цикла. Следовательно, требуется мягкое обращение с животными во время их отлова, изоляции и мужа.
Концентрации пищи должны часто контролироваться и корректироваться. Это особенно верно на стадии развития личинок и озооидов. Этот метод специально разработан для выращивания мелких видов зоопланктона у основания морской пищевой сети.
Этот метод будет посвя быть ценным, например, для изучения реакции зоопланктона на изменение климата. С момента своего развития, этот метод проложил путь для экологов зоопланктона, чтобы определить лабораторное питание, рост и темпы воспроизводства doliolids. Кроме того, этот метод проложил путь для революционных молекулярных исследований долиолидной диеты в природе.
Напомню, что протокол очистки стекла включает в себя реагенты, которые являются респираторными раздражителями и должны использоваться в хорошо проветриваемых помещениях. Работа в море также может быть опасной, поэтому следуйте правилам безопасности судна.
