Cultivation du Tunicate pélagique marin Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) pour les études expérimentales

La disponibilité d’organismes modèles culturables a été essentielle à l’avancement dans de nombreux domaines d’étude. Ce protocole, à notre connaissance, est la seule approche disponible pour la culture des Doliolids. La technologie de culture fiable du Doliolid fournit un modèle expérimental unique pour étudier les organismes qui sont importants pour certaines des régions les plus productives de l’océan et qui représentent les premiers ancêtres évolutionnaires des vertébrés.

Cette technique est unique car elle maintient les particules de nourriture algale et les organismes suspendus dans la colonne d’eau sans contact avec les parois du récipient comme ils l’expérience dans la nature. Cette méthode de culture peut être appliquée à la culture d’autres petites espèces gélatineuses et crustacées ou planctoniques. Parce que les doliolids ont un cycle de vie complexe, il est essentiel de comprendre et de reconnaître les besoins de chaque étape de la vie.

Apprendre le cycle de vie et comment les reconnaître et les manipuler demande beaucoup de pratique. D’après notre expérience, la seule façon d’apprendre cette technique de culture est de la voir et de la faire. Plusieurs autres participants au projet, dont Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago et Terrell Scarborough, sont également apparus brièvement dans cette vidéo.

Avant d’établir et d’élever les cultures Doliolid en laboratoire, nettoyez et stérilisez les pots de culture en verre de 1,9 et 3,8 litres en les immergeant dans la solution de permanganate de potassium hydroxyde de sodium. Laisser tremper les pots toute la nuit. Transférer ensuite les pots dans la solution de bisulfite de sodium.

Laisser tremper les pots toute la nuit. Rincez ensuite soigneusement les bocaux à l’eau déionisée. Laisser sécher les bocaux.

Pour maintenir les cultures de stock, utilisez des techniques de culture axenique rigoureuses. Toutes les deux semaines, transférez 0,5 millilitres d’ancienne culture sénescente à 25 millilitres de supports de croissance frais dans des tubes stériles de culture du verre de 55 millilitres. Pour préparer de plus grands volumes de phytoplancton pour nourrir les doliolids, transférez quatre millilitres du phytoplancton des stocks axeniques en flacons de culture tissulaire plastique de 500 millilitres contenant 200 millilitres de supports de croissance pour inoculer à une à 50 dilutions.

Incubez la culture dans un incubateur environnemental ou une chambre environnementale sans rendez-vous à 20 degrés Celsius avec un cycle clair-obscurité de 12 à 12 heures sous un éclairage de lumière blanche fraîche de 65 à 85 microEinsteins par mètre carré. Poser les flacons de culture à plat pour maximiser l’illumination. Faites tourbillonner doucement la culture tous les jours.

Dirigez-vous vers la mer. Pour localiser les doliolidés sur le plateau continental, déployer l’instrument océanographique CTD pour identifier les conditions d’eau propices à la présence de Doliolidés en profilant la température de l’eau, la salinité et la fluorescence de la chlorophylle A. Confirmez les conditions de l’eau en effectuant des remorques exploratoires avec des filets planctoniques spécialisés.

Vous pouvez également utiliser un système d’imagerie de profilage in situ pour détecter les doliolids. Maintenant, actionner le treuil pour récupérer le CTD. Les bouteilles Niskin montées sur la rosette CTD ont recueilli l’eau de mer sur le site où se trouvent les Doliolidés et à la profondeur contenant les estimations les plus élevées de chlorophylle.

Rincer trois seaux de 22 litres avec de l’eau de mer et remplir d’eau de mer à un peu plus de la moitié plein. Remplissez complètement l’extrémité nette de la morue avec de l’eau de mer et fixez l’extrémité de la morue au filet. Déployez le filet.

Abaissez et soulevez le filet à travers la colonne d’eau, en maintenant un angle oblique de remorquage de 15 à 25 degrés et la vitesse verticale de déploiement et de récupération ne dépassant pas 15 mètres par minute. Une fois que le filet est à bord, transférez et divisez doucement le contenu de l’extrémité de la morue en seaux en plastique contenant chacun de l’eau de mer de surface recueillie sur le site. À l’aide d’une pipette en verre à alésage large, mélanger délicatement le contenu du bécher avec la pipette à l’aide de mouvements verticaux et horizontaux.

À l’aide de l’index, créer une aspiration capillaire pour capturer et transférer les Doliolids. Capturez les doliolids à partir de phytoplancton mélangé dans le bécher. Après l’ajout de Doliolids, ajouter la culture Rhodomonas dans le bocal à une concentration finale d’environ cinq fois 10 à la troisième à 10 à la quatrième cellule par millilitre.

Vérifiez la couleur du tube digestif des Doliolids. La couleur rouge détermine que les Doliolids se nourrissent activement. Pour éviter que les doliolids ne soient piégés à l’interface air-eau, remplissez complètement les bocaux d’eau de mer non filtrée et riche en particules pour éviter l’espace libre.

Placer un morceau de pellicule plastique sur l’ouverture du bocal. Évitez de créer des bulles d’air qui peuvent également endommager les animaux. Vissez soigneusement le bouchon sur le bocal et inversez doucement le bocal pour déterminer si des bulles sont présentes.

Si des bulles sont présentes, remplissez plus d’eau de mer pour les enlever. Après que les pots sont remplis reseal avec le couvercle et essuyer l’excès d’eau de l’extérieur du bocal. Montez chaque bocal sur la roue planctonique en plaçant le bocal sur les barres métalliques verticales recouvertes de tuyaux en caoutchouc et entre une pince à tuyaux en acier inoxydable.

Assurez-vous que l’arrière du bocal est amorti contre le tube en caoutchouc. Ajustez la vis pour serrer la pince du tuyau autour du bocal. Laissez les pots tourner à 0,3 rpm pour maintenir les Doliolids en suspension.

Après trois jours d’acclimation aux conditions de laboratoire transférer 100 à 150 millilitres d’eau de culture du pot à un récipient d’échantillon et mesurer la concentration d’algues à l’aide d’un compteur Coulter. Sur la base de l’estimation de la concentration d’algues, ajouter suffisamment d’algues pour porter la concentration dans le pot de culture à 40 à 95 microgrammes de carbone par litre. Utilisez le compteur de particules pour surveiller les concentrations d’algues après que les Doliolids se sont nourris pour guider la décision de la fréquence et de la quantité d’algues à ajouter aux cultures.

Maintenir les concentrations de phytoplancton dans les pots de culture entre 40 et 95 microgrammes de carbone par litre. La culture des doliolids nécessite de les soutenir tout au long de leur cycle de vie compliqué. Développer des larves et des oozoïdes et des infirmières précoces.

Une fois qu’un minimum de huit trophozoïdes sont visibles sur le cataphor de l’infirmière, transférez au moins quatre infirmières dans un nouveau bocal de culture. Une fois que les phorozoïdes atteignent trois millimètres de taille, réduisez le nombre d’animaux dans le bocal. Lorsque les phorozoïdes deviennent plus grands que cinq millimètres et ont développé des grappes gonozoïdes enlever tous les phorozoïdes sauf quatre.

Ce protocole donne un aperçu d’une approche de collection et de culture de Dolioletta gegenbauri. Les taux de dégagement des algues étaient semblables à des concentrations de 20 à 60 microgrammes de carbone par litre et diminuaient à mesure que les concentrations alimentaires augmentaient. Les taux de dégagement ont augmenté proportionnellement sur des gammes de température favorables à la croissance de D.gegenbauri.

Des taux de croissance allant de 0,1 à 0,7 millimètre par jour en fonction de la température et de la disponibilité des aliments ont été observés. La culture des Doliolids dépend de la reproduction réussie des conditions océaniques et de l’adaptation aux besoins des animaux tout au long de leur cycle de vie compliqué. Par conséquent, une manipulation douce des animaux pendant leur capture, leur isolement et leur élevage est nécessaire.

Les concentrations alimentaires doivent être surveillées fréquemment et ajustées. Cela est particulièrement vrai pendant les larves en développement et les stades de vie oozoïdes. Cette méthode est spécifiquement conçue pour l’élevage de petites espèces de zooplancton à la base du réseau alimentaire marin.

Cette méthode sera utile, par exemple, pour étudier les réponses du zooplancton au changement climatique. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux écologistes du zooplancton pour déterminer les taux d’alimentation, de croissance et de reproduction en laboratoire des Doliolids. En outre, cette méthode a ouvert la voie à des études moléculaires révolutionnaires du régime Doliolid dans la nature.

Je tiens à vous rappeler que le protocole de nettoyage du verre implique des réavants irritants respiratoires et qui devraient être utilisés dans des zones bien ventilées. Travailler en mer peut également être dangereux, alors suivez les règles de sécurité des navires.