Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais

A disponibilidade de organismos modelos culturais tem sido fundamental para o avanço em muitos campos de estudo. Este protocolo, pelo que sabemos, é a única abordagem disponível para a cultura de Doliolids. A tecnologia de cultura doliolida confiável fornece um modelo experimental único para estudar organismos que são importantes para algumas das regiões mais produtivas do oceano e que representam os primeiros ancestrais evolutivos dos vertebrados.

Esta técnica é única, pois mantém as partículas de alimentos algas e os organismos suspensos na coluna de água sem contato com as paredes do recipiente como experimentam na natureza. Este método de cultivo pode ser aplicado à cultura de outras pequenas espécies gelatinosas e crustáceas ou plâncton. Como os doliólitos têm um ciclo de vida complexo, compreender e reconhecer as necessidades de cada fase da vida é fundamental.

Aprender o ciclo de vida e como reconhecê-los e lidar com eles requer muita prática. Em nossa experiência, a única maneira de aprender essa técnica de cultivo é vê-la e fazê-la. Vários outros participantes do projeto, incluindo Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago e Terrell Scarborough também apareceram brevemente neste vídeo.

Antes de estabelecer e criar culturas Doliolid em laboratório, limpe e esterilize potes de cultura de vidro de 1,9 e 3,8 litros, imergindo-os na solução de permangênio de hidróxido de sódio. Deixe os frascos de molho durante a noite. Em seguida, transfira os frascos para a solução de bisulfito de sódio.

Deixe os frascos de molho durante a noite. Em seguida, enxágue os frascos completamente com água deionizada. Deixe os frascos secarem.

Para manter as culturas de estoque, use rigorosas técnicas de cultura axenica. A cada duas semanas transfere 0,5 mililitros da velha cultura senescente para 25 mililitros de mídia de crescimento fresco em tubos de cultura de vidro estéril de 55 mililitros. Para preparar volumes maiores de fitoplâncton para alimentar Doliolids, transfira de fitoplâncton de estoques axeônicos para frascos de cultura de tecido plástico de 500 mililitros contendo 200 mililitros de mídia de crescimento para inocular em uma a 50 diluição.

Incubar a cultura em uma incubadora ambiental ou câmara ambiental a 20 graus Celsius com um ciclo claro-escuro de 12 a 12 horas sob iluminação de luz branca fria de 65 a 85 microEinsteínas por metro quadrado. A cultura leiga é plana para maximizar a iluminação. Gentilmente redemoinho a cultura diariamente.

Vá para o mar. Para localizar Doliódes na plataforma continental, implante o instrumento oceanográfico CTD para identificar condições de água propícias à presença de Doliolids por meio de perfil de temperatura da água, salinidade e clorofila A fluorescência. Confirme as condições da água realizando reboques exploratórios com redes especializadas de plâncton.

Alternativamente, use um sistema de imagem de perfil in situ para detectar Doliolids. Agora opere o guincho para recuperar o CTD. As garrafas Niskin montadas na roseta CTD coletaram água do mar do local onde estão localizados Doliolids e na profundidade contendo as maiores estimativas de clorofila.

Enxágüe três baldes de 22 litros com água do mar e encha com água do mar a pouco mais da metade cheia. Encha a extremidade do bacalhau líquido completamente com água do mar e conecte a extremidade do bacalhau à rede. Implante a rede.

Abaixe e levante a rede através da coluna de água, mantendo um ângulo de reboque oblíquo de 15 a 25 graus e a implantação vertical e velocidade de recuperação não superior a 15 metros por minuto. Uma vez que a rede esteja a bordo, transfira suavemente e divida o conteúdo da extremidade do bacalhau para os baldes de plástico cada um contendo água do mar superficial coletada do local. Usando uma pipeta de vidro de furo largo misture suavemente o conteúdo do béquer com a pipeta usando movimentos verticais e horizontais.

Usando o dedo indicador, crie sucção capilar para capturar e transferir Doliolids. Capture os Doliódes de fitoplâncton misto no béquer. Após a adição de Doliolids, adicione a cultura rhodomonas no frasco a uma concentração final de cerca de cinco vezes 10 para a terceira a 10 para as quatro células por mililitro.

Verifique a cor do trato digestivo dos doliódes. A cor vermelha determina que os Doliódes estão se alimentando ativamente. Para evitar que Os Doliódes estejam presos na interface ar-água, encha completamente os frascos com água do mar não filtrada e rica em partículas para evitar o espaço da cabeça.

Coloque um pedaço de plástico sobre a abertura do frasco. Evite criar bolhas de ar que também possam danificar os animais. Aparafusar cuidadosamente a tampa sobre o frasco e inverter suavemente o frasco para determinar se as bolhas estão presentes.

Se as bolhas estiverem presentes, encha mais água do mar para removê-las. Depois que os frascos forem preenchidos com a tampa e limpar o excesso de água do lado de fora do frasco. Coloque cada frasco na roda de plâncton colocando o frasco nas barras de metal verticais cobertas com tubos de borracha e entre um grampo de mangueira de aço inoxidável.

Certifique-se de que a parte de trás do frasco está amortecida contra o tubo de borracha. Ajuste o parafuso para apertar o grampo da mangueira ao redor do frasco. Deixe os frascos girarem a 0,3 rpm para manter os Doliolids em suspensão.

Após três dias de aclimatação para as condições laboratoriais, transfira de 100 a 150 mililitros de água cultural do frasco para um recipiente de amostra e meça a concentração de algas usando um contador Coulter. Com base na estimativa de concentração de algas, adicione algas suficientes para elevar a concentração no frasco de cultura para 40 a 95 microgramas de carbono por litro. Use o contador de partículas para monitorar as concentrações de algas depois que os Doliódes se alimentarem para orientar a decisão de quanta frequência e quanto algas adicionar às culturas.

Mantenha concentrações de fitoplâncton nos frascos de cultura entre 40 e 95 microgramas de carbono por litro. Culturing Doliolids requer apoiá-los através de seu complicado ciclo de vida. Desenvolvendo larvas e oozoóides e enfermeiras precoces.

Uma vez que um mínimo de oito trophozoóides são visíveis no catafora da enfermeira, transfira pelo menos quatro enfermeiras para um novo frasco de cultivo. Uma vez que os phorozoóides atingem três milímetros de tamanho, reduza o número de animais no frasco. Quando os phorozoóides se tornam maiores que cinco milímetros e desenvolveram aglomerados gonozoóides removem todos, exceto quatro phorozoóides.

Este protocolo fornece uma visão geral de uma abordagem de coleta e cultivo de Dolioletta gegenbauri. As taxas de despejo de algas foram semelhantes nas concentrações de 20 a 60 microgramas de carbono por litro e diminuíram à medida que as concentrações alimentares aumentavam. As taxas de despejo aumentaram proporcionalmente sobre as faixas de temperatura que apoiam o crescimento de D.gegenbauri.

Foram observadas taxas de crescimento variando de 0,1 a 0,7 milímetros por dia em função da temperatura e disponibilidade de alimentos. O cultivo de Doliolids depende de replicar com sucesso as condições oceânicas e acomodar as necessidades dos animais ao longo de seu complicado ciclo de vida. Consequentemente, é necessário um manuseio suave dos animais durante sua captura, isolamento e criação.

As concentrações alimentares devem ser monitoradas com frequência e ajustadas. Isso é particularmente verdadeiro durante as fases de vida das larvas e oozoóides em desenvolvimento. Este método é especificamente projetado para a criação de pequenas espécies de zooplâncton na base da teia alimentar marinha.

Este método será valioso, por exemplo, para investigar as respostas do zooplâncton às mudanças climáticas. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os ecologistas zooplânctons determinarem as taxas de alimentação, crescimento e reprodução de doliódicos baseados em laboratório. Além disso, este método abriu caminho para investigações revolucionárias de base molecular da dieta doliolida na natureza.

Gostaria de lembrá-lo que o protocolo de limpeza de vidro envolve reagentes que são irritantes respiratórios e devem ser usados em áreas bem ventiladas. Trabalhar no mar também pode ser perigoso, então siga as regras de segurança do navio.