La disponibilità di organismi modello culturabili è stata fondamentale per il progresso in molti campi di studio. Questo protocollo, per quanto ne sappiamo, è l'unico approccio disponibile per coltivare i Doliolidi. L'affidabile tecnologia di coltura doliolidi fornisce un modello sperimentale unico per studiare organismi che sono importanti per alcune delle regioni più produttive dell'oceano e che rappresentano i primi antenati evolutivi dei vertebrati.
Questa tecnica è unica in quanto mantiene le particelle di cibo algale e gli organismi sospesi nella colonna d'acqua senza contatto con le pareti del contenitore come sperimentano in natura. Questo metodo di coltivazione può essere applicato alla coltivazione di altre piccole specie gelatinose e crostacee o plancton. Poiché i Doliolidi hanno un ciclo di vita complesso, comprendere e riconoscere le esigenze di ogni fase della vita è fondamentale.
Imparare il ciclo di vita e come riconoscerli e gestirli richiede molta pratica. Nella nostra esperienza, l'unico modo per imparare questa tecnica di coltivazione è vederla e farlo. Molti altri partecipanti al progetto, tra cui Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago e Terrell Scarborough, sono apparsi brevemente in questo video.
Prima di stabilire e allevare colture doliolidi in laboratorio, pulire e sterilizzare barattoli di coltura del vetro da 1,9 e 3,8 litri immergendoli nella soluzione di permanganato di potassio idrossido di sodio. Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte. Quindi trasferire i barattoli nella soluzione di bisolfito di sodio.
Lasciare in ammollo i barattoli durante la notte. Quindi sciacquare accuratamente i barattoli con acqua deionizzata. Lasciare asciugare i barattoli.
Per mantenere le colture di stock, utilizzare rigorose tecniche di coltura axenica. Ogni due settimane trasferire 0,5 millilitri di vecchia coltura senescente a 25 millilitri di mezzi di crescita freschi in tubi sterili di coltura del vetro da 55 millilitri. Per preparare volumi maggiori di fitoplancton per l'alimentazione dei Doliolidi, trasferire quattro millilitri del fitoplancton dalle scorte axeniche in contenitori di coltura di tessuti plastici da 500 millilitri contenenti 200 millilitri di mezzi di crescita per inoculare a una o 50 diluizione.
Incubare la coltura in un incubatore ambientale o in una camera ambientale walk-in a 20 gradi Celsius con un ciclo luce-buio di 12-12 ore sotto un'illuminazione fredda a luce bianca da 65 a 85 microEinstein per metro quadrato. Stendere le fiasche di coltura piatte per massimizzare l'illuminazione. Ruota delicatamente la cultura ogni giorno.
Vai in mare. Per localizzare i Doliolidi sulla piattaforma continentale, implementare lo strumento oceanografico CTD per identificare le condizioni dell'acqua che favoriscono la presenza di Doliolidi profilando la temperatura dell'acqua, la salinità e la fluorescenza della clorofilla A. Confermare le condizioni dell'acqua conducendo scrofe di rete esplorativa con reti di plancton specializzate.
In alternativa, utilizzare un sistema di imaging di profilatura in situ per rilevare i Doliolidi. Ora aziona il verricello per recuperare il CTD. Le bottiglie Niskin montate sulla rosetta CTD raccoglievano l'acqua di mare dal sito in cui si trovano i Doliolidi e alla profondità contenente le più alte stime di clorofilla.
Risciacquare tre secchi da 22 litri con acqua di mare e riempire con acqua di mare a poco più della metà piena. Riempire completamente l'estremità del merluzzo della rete con acqua di mare e attaccare l'estremità del merluzzo alla rete. Distribuire la rete.
Abbassare e sollevare la rete attraverso la colonna d'acqua, mantenendo un angolo di traino obliquo di 15-25 gradi e una velocità di distribuzione e recupero verticale non superiore a 15 metri al minuto. Una volta che la rete è a bordo trasferire delicatamente e dividere il contenuto del sacco nei secchi di plastica ciascuno contenente l'acqua di mare di superficie raccolta dal sito. Utilizzando una pipetta di vetro a foro largo mescolare delicatamente il contenuto del becher con la pipetta utilizzando movimenti verticali e orizzontali.
Utilizzando l'indice, creare l'aspirazione capillare per catturare e trasferire i Doliolidi. Cattura i Doliolidi dal fitoplancton misto nel becher. Dopo l'aggiunta di Doliolidi, aggiungere la coltura di Rhodomonas nel barattolo a una concentrazione finale di circa cinque volte 10 alla terza a 10 alla quarta cellule per millilitro.
Controlla il colore del tratto digestivo delle Doliolidi. Il colore rosso determina che i Doliolidi si nutrono attivamente. Per evitare che i Doliolidi siano intrappolati nell'interfaccia aria-acqua, riempire completamente i vasi con acqua di mare non filtrata e ricca di particelle per evitare lo spazio della testa.
Posizionare un pezzo di involucro di plastica sopra l'apertura del barattolo. Evita di creare bolle d'aria che possono anche danneggiare gli animali. Avvitare con cura il cappuccio sul barattolo e invertire delicatamente il barattolo per determinare se sono presenti bolle.
Se sono presenti bolle, riempire più acqua di mare per rimuoverle. Dopo che i barattoli sono stati riempiti di reseal con il coperchio e pulire l'acqua in eccesso dall'esterno del barattolo. Montare ogni barattolo sulla ruota del plancton posizionando il barattolo sulle barre verticali metalliche coperte da tubi di gomma e tra un morsetto del tubo in acciaio inossidabile.
Assicurarsi che la parte posteriore del barattolo sia ammortizzata contro i tubi di gomma. Regolare la vite per stringere il morsetto del tubo intorno al barattolo. Lasciare ruotare i barattoli a 0,3 giri/min per mantenere i Doliolidi in sospensione.
Dopo tre giorni di acclimatazione alle condizioni di laboratorio trasferire da 100 a 150 millilitri di acqua di coltura dal barattolo a un contenitore campione e misurare la concentrazione di alghe utilizzando un contatore Coulter. Sulla base della stima della concentrazione di alghe, aggiungere alghe sufficienti per portare la concentrazione nel barattolo di coltura a 40-95 microgrammi di carbonio per litro. Utilizzare il contatore delle particelle per monitorare le concentrazioni di alghe dopo che i Doliolidi si sono nutriti per guidare la decisione della frequenza e della quantità di alghe da aggiungere alle colture.
Mantenere le concentrazioni di fitoplancton nei vasi di coltura tra 40 e 95 microgrammi di carbonio per litro. Coltivare i Doliolidi richiede di sostenerli attraverso il loro complicato ciclo di vita. Sviluppo di larve e oozooidi e prime infermiere.
Una volta che un minimo di otto trofozooidi sono visibili sul cataforo dell'infermiera, trasferire almeno quattro infermiere in un nuovo barattolo di ristrutturazione. Una volta che i forozooidi raggiungono i tre millimetri di dimensione, ridurre il numero di animali nel barattolo. Quando i forozooidi diventano più grandi di cinque millimetri e hanno sviluppato ammassi gonozooidi rimuovere tutti tranne quattro forozooidi.
Questo protocollo fornisce una panoramica di un approccio di raccolta e coltivazione dei gegenbauri Dolioletta. I tassi di clearance delle alghe erano simili a concentrazioni da 20 a 60 microgrammi di carbonio per litro e diminuivano con l'aumentare delle concentrazioni alimentari. I tassi di clearance sono aumentati proporzionalmente rispetto agli intervalli di temperatura a sostegno della crescita di D.gegenbauri.
Sono stati osservati tassi di crescita che vanno da 0,1 a 0,7 millimetri al giorno in funzione della temperatura e della disponibilità di cibo. La coltivazione dei Doliolidi dipende dalla replicazione con successo delle condizioni oceaniche e dall' accoglienza delle esigenze degli animali durante il loro complicato ciclo di vita. Di conseguenza, è necessaria una manipolazione delicata degli animali durante la cattura, l'isolamento e l'allevamento.
Le concentrazioni alimentari devono essere monitorate frequentemente e regolate. Questo è particolarmente vero durante le larve in via di sviluppo e le fasi di vita oozooide. Questo metodo è specificamente progettato per l'allevamento di piccole specie di zooplancton alla base della rete alimentare marina.
Questo metodo sarà prezioso, ad esempio, per indagare le risposte dello zooplancton al cambiamento climatico. Dal suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada agli ecologisti dello zooplancton per determinare i tassi di alimentazione, crescita e riproduzione dei Doliolidi basati sul laboratorio. Inoltre questo metodo ha spianato la strada a rivoluzionarie indagini molecolari della dieta doliolide in natura.
Vorrei ricordarvi che il protocollo di pulizia del vetro prevede reagenti irritanti per le vie respiratorie che dovrebbero essere utilizzati in aree ben ventilate. Lavorare in mare può anche essere pericoloso, quindi segui le regole di sicurezza della nave.
