可分化モデル生物の利用可能性は、多くの研究分野における進歩の基本となってきた。このプロトコルは、私たちの知る限り、ドリオリッドを培養するために利用可能な唯一のアプローチです。信頼できるドリオライドの文化技術は、海洋の最も生産的な地域のいくつかにとって重要であり、脊椎動物の最も初期の進化の祖先を表す生物を研究するためのユニークな実験モデルを提供します。
この技術は、藻類の食品粒子と生物が自然界で経験する容器の壁に接触することなく、水柱に浮遊し続けるのでユニークです。この培養方法は、他の小さなゼラチン系および甲殻類またはプランクトン種の培養に適用することができる。Doliolidsは複雑なライフサイクルを持っているので、各ライフステージのニーズを理解し、認識することが重要です。
ライフサイクルを学び、それらを認識して処理する方法を学ぶには、多くの練習が必要です。私たちの経験では、この培養技術を学ぶ唯一の方法は、それを見てそれを行うです。エリン・アルネソン、ニコラス・カスタリン、ナタリア・ロペス、ローレン・ランボイエ、ブリアナ・ピアース、アーヤ・ロドリゲス=サンティアゴ、テレル・スカボローを含む他のいくつかのプロジェクト参加者も、このビデオに短時間登場しました。
実験室でドリオリッド培養を確立し、飼育する前に、1.9リットルおよび3.8リットルのガラス培養瓶を過マンガン酸ナトリウム溶液に浸して洗浄し、殺菌する。瓶を一晩浸します。その後、亜硫酸ナトリウム溶液に瓶を移します。
瓶を一晩浸します。次に、脱イオン水で瓶を十分に洗い流します。瓶を乾かします。
ストックカルチャを維持するには、厳格な無数の培養技術を使用します。2週間ごとに、古い老化培養の0.5ミリリットルを無菌55ミリリットルガラス培養チューブ中の新鮮な成長培地の25ミリリットルに移す。ドリオリッドに供給するための植物プランクトンの大量を調製するには、植物プランクトンの4ミリリットルを無分離株から200ミリリットルの成長培地を含む500ミリリットルのプラスチック組織培養フラスコに移し、1〜50希釈で接種する。
1平方メートルあたり65〜85マイクロEinsteinのクールな白色光照明の下で12〜12時間の明暗サイクルで20°Cの環境インキュベーターまたはウォークイン環境室で培養します。培養フラスコを平らにして、照明を最大限に引き出します。毎日、穏やかに文化を渦巻く。
海に向かおう。大陸棚にドリオリッドを配置するには、水温、塩分、クロロフィルA蛍光をプロファイリングすることによって、ドリオリッドの存在に資する水の状態を特定するための海洋機器CTDを展開します。専用プランクトンネットで探索的ネットトウを行うことで、水の状態を確認します。
あるいは、ドリオリッドを検出するためにin situプロファイリングイメージングシステムを使用する。今度は、CTDを取得するためにウィンチを操作します。CTDロゼットに取り付けられたニスキンボトルは、ドリオリッドがある場所とクロロフィルの最も高い推定値を含む深さから海水を収集しました。
海水で3つの22リットルのバケツをすすいで、海水で満タンに半分以上いっぱいにします。網タラの端を海水で完全に満たし、タラの端をネットに取り付けます。ネットを展開します。
水柱を通してネットを下げて上げ、斜めの牽引角度を15〜25度、垂直展開と検索速度を1分あたり15メートル以下に保ちます。ネットがボード上に入ると、タラの端の内容物をサイトから収集した表面海水を含むプラスチック製のバケツにそっと移して分割します。広孔ガラスピペットを使用して、垂直および水平の動きを使用して、ビーカーの内容物とピペットを穏やかに混ぜます。
人差し指を使用して、毛細管吸引を作成してドリオリッドを捕獲し、移送する。ビーカーの混合植物プランクトンからドリオリッドを捕獲する。ドリオリッドを添加した後、ロドドニアス培養液を瓶に加え、1ミリリットル当たり4番目の細胞に約10〜3番目から10の最終濃度に加える。
ドリオリッドの消化管の色を確認してください。赤い色はドリオリッドが積極的に供給していることを決定します。ドリオリッドが空気と水の界面に閉じ込められるのを防ぐために、ヘッドスペースを避けるために、濾過されていない粒子が豊富な海水で瓶を完全に満たします。
瓶の開口部にラップを置きます。動物にダメージを与える可能性のある気泡を作らないようにしてください。慎重に瓶にキャップをねじ込み、そっと瓶を反転して、泡が存在するかどうかを判断します。
気泡が存在する場合は、それらを除去するために、より多くの海水を埋めます。瓶を充填した後、蓋で再シールし、瓶の外側から余分な水を拭きます。各瓶をプランクトンホイールに取り付け、ゴムチューブで覆われた垂直金属バーとステンレス製のホースクランプの間にジャーを置きます。
瓶の裏がゴムチューブにクッションされていることを確認します。ねじを調整して、ホースクランプを締めます。瓶を0.3 rpmで回転させ、ドリオリッドをサスペンションに保ちます。
実験室条件に3日間順応した後、瓶から100〜150ミリリットルの培養水をサンプル容器に移し、コールターカウンターを使用して藻類濃度を測定する。藻類濃度の推定に基づいて、培養瓶中の濃度を1リットル当たり40〜95マイクログラムにする十分な藻類を加える。ドリオリッドが餌を与えた後の藻類濃度を監視するために粒子カウンターを使用して、藻類が培養にどの程度の頻度で添加するかを決定します。
1リットル当たり40~95マイクログラムの培養瓶中の植物プランクトン濃度を維持する。ドリオリッドを培養するには、複雑なライフサイクルを通じてそれらをサポートする必要があります。幼虫とウーズーイドと初期の看護師を開発する。
看護師のカタプホルに少なくとも8人の栄養動物が見えたら、少なくとも4人の看護師を新しい培養瓶に移す。蓄音動物の大きさが3ミリメートルに達したら、瓶の中の動物の数を減らします。時に、ホスホウズイドが5ミリメートルより大きくなり、ゴノズーイドクラスターが開発された場合、4つの動物を除くすべてが除去されます。
このプロトコルは、ドリオレッタ・ゲゲンバウリの収集と栽培アプローチの概要を提供します。藻類クリアランス率は、1リットル当たり炭素の20〜60マイクログラムの濃度で類似し、食品濃度が増加するにつれて減少した。クリアランス率は、D.gegenbauriの成長を支持する温度範囲に比例して増加した。
温度と食料の利用可能性の関数として、1日あたり0.1〜0.7ミリメートルの成長率が観察された。ドリオリッドの栽培は、海洋条件を正常に複製し、複雑なライフサイクルを通じて動物のニーズに対応することに依存しています。その結果、捕獲、隔離、および畜産の間に動物の穏やかな取り扱いが必要である。
食品濃度は頻繁に監視し、調整する必要があります。これは、発達中の幼虫およびウーズーイドの生命段階において特に当てはまる。この方法は、海洋食物網の基部にある小さな動物プランクトン種の飼育のために特別に設計されている。
この方法は、例えば、気候変動に対する動物プランクトンの反応を調査する上で有用である。開発以来、この技術は、動物プランクトン生態学者がドリオリッドの実験室ベースの摂食、成長、および繁殖率を決定する道を開いた。さらに、この方法は、自然界のドリオリッド食の革命的な分子ベースの調査への道を開いた。
ガラス洗浄プロトコルには呼吸刺激薬であり、換気の良い場所で使用する試薬が含まれることを思い出させてください。海上での作業も危険であるため、船の安全規則に従ってください。
