Наша лаборатория разрабатывает искусственные иммунные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы, и изучает, как они влияют на регуляторную биологию Т-клеток. Изобретая новые последовательности ДНК и используя гуманизированные мышиные модели заболеваний, мы стремимся создать инженерную иммунную клеточную терапию аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, рака и старения. При разработке химерных антигенных рецепторов для регуляторных Т-клеток крайне важно учитывать их прочность.
Высокоаффинные CAR Tregs ведут себя больше как эффекторные Т-клетки, продуцируя повышенное количество воспалительных цитокинов и демонстрируя большую киллерную активность. Наши текущие исследования показывают, что снижение аффинности к CAR приводит к улучшению профилей цитокинов и функции CAR Tregs. Область CAR Treg находится в зачаточном состоянии и не поддается стандартизации.
Наш протокол представляет собой надежный, универсальный подход к генерации и тестированию CAR Tregs. Это повышает воспроизводимость и ускоряет внедрение инноваций, а также направляет лаборатории, не знакомые с исследованиями CAR Treg, особенно с учетом проблем дефицита TREG и специализированных требований. Мы изучаем механизмы, которые регуляторные Т-клетки используют для поддержания иммунного баланса и ускорения заживления тканей.
Наши исследования включают в себя понимание передачи сигналов и функции CAR Treg, а также изучение новых контекстов заболевания, в которых терапия CAR Treg может предложить уникальные преимущества по сравнению с существующими стратегиями. Для начала переложите содержимое лейкопака в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте равный объем DPBS с 2% фетальной бычьей сывороткой и аккуратно перемешайте пипеткой.
Вращайте трубку при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. После того, как надосадочная жидкость будет аспирирована, восстановите клеточную гранулу в двух миллилитрах DPBS с 2% фетальной бычьей сывороткой. Затем добавьте в клеточную суспензию восемь миллилитров раствора хлорида аммония и перемешайте путем мягкой инверсии.
После обрыва отвертеть промытые ячейки при 150г в течение 10 минут при комнатной температуре. После аспирации надосадочной жидкости суспендировать клеточную гранулу в 30 миллилитрах DPBS с 2%-ной фетальной бычьей сывороткой. Затем уменьшите 10 до степени от восьми до 10 до степени девяти PBMC при 500g в течение пяти минут при комнатной температуре.
И ресуспендировать в клеточном разделительном буфере в концентрации пять умно-10 в степени семи клеток на миллилитр. Для флуоресцентной сортировки регуляторных Т-клеток вращайте CD4-положительные клетки в дозе 500 г в течение пяти минут. Затем восстановите клетки в 200 микролитрах DPBS.
На каждый миллион клеток добавьте один микролитр античеловеческого CD4 FITC, один микролитр античеловеческого CD25 APC и один микролитр античеловеческого CD127 PE. Аккуратно перекрутив трубку, поместите ее в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 30 минут. После того, как клетки промыты 10 миллилитрами DPBS с 2% фетальной бычьей сывороткой, вращают их в 500 г в течение пяти минут и аккуратно ресуспендируют окрашенные клетки в 1,5 умножить на 10 в степени семи клеток на миллилитр в DPBS с 2% фетальной бычьей сывороткой. Затем пропустите окрашенную клеточную суспензию через 40-микрометровый фильтрующий колпачок в пробирки для сортировки клеток с флуоресценцией.
Подготовьте 15-миллилитровые пробирки для сбора, содержащие три миллилитра среды RPMI10, и положите их на лед. Наконец, отсортируйте CD4-положительные, CD25 высокие, CD127 отрицательные регуляторные Т-клетки и CD4-положительные, CD25 низкие, CD127-положительные обычные Т-клетки с помощью флуоресцентной сортировки. Для начала возьмите регуляторные Т-клетки, выделенные из крови человека, через 48 часов после активации и ресуспендируйте их.
После подсчета ячеек крутим при 500г в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендировать регуляторные Т-клетки в RPMI10 в 1,25 умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр с 1000 международных единиц на миллилитр интерлейкина-2. Теперь прибавьте аликвоту каждого лентивируса в 2,5 раза по 10 в степени пяти регуляторных Т-клеток в 200 микролитрах в микроцентрифужной пробирке.
Спинокулируйте при 1 000 г в течение одного часа при температуре 32 градуса Цельсия. Переместите каждую реакцию на 200 микролитров в 24-луночный планшет. Инкубируйте планшет с трансдуцированными регуляторными Т-клетками в инкубаторе для тканевых культур на ночь.
Доливайте в каждую лунку до двух миллилитров среду RPMI10 с конечной концентрацией интерлейкина-2 1000 международных единиц на миллилитр. Оцените эффективность модификации генов с помощью проточной цитометрии, как показано здесь. Для начала принимайте ресуспендированные регуляторные Т-клетки с шариками анти-CD3, CD28 в конической пробирке объемом 15 миллилитров через 48 часов после активации.
Инкубируйте клеточную суспензию в магните в течение трех минут. Находясь в магните, перенесите клетки в среде с помощью пипетки в новую пробирку. После удаления гранул дайте очищенным от гранул регуляторным Т-клеткам отдохнуть в RPMI10 в течение двух часов.
Затем вращайте регуляторные Т-клетки в дозе 500г в течение пяти минут. После того, как надосадочная жидкость сцежена, ресуспендируйте клетки в предварительно подогретой восстановившейся сыворотке в соотношении четыре раза по 10 в степени шести клеток на миллилитр. Аликвотные клетки по 100 микролитров в центрифужных пробирках с низким связыванием белков объемом 1,5 миллилитров.
Добавьте вирус аденоассоциированного рецептора химерного антигена при кратности инфекции 20 000 к каждому образцу и повторите. Затем инкубируйте реакционные пробирки в инкубаторе для тканевых культур в течение одного часа. Во время инкубации готовят рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas9 путем добавления 8,3 мкл белка Cas9 к 2,5 мкл одиночной направляющей РНК, нацеленной на локус трек-гена.
После тщательного перемешивания компонентов инкубировать смесь рибонуклеопротеинов в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур. Затем заполните свежую электропориционную трубку тремя миллилитрами высокоосмолярного электропориционного буфера. Вставьте заполненную электропорационную трубку в пипетную станцию электропорационной системы до щелчка.
Установите условия электропорации на 2, 200 вольт, 20 миллисекунд, один импульс в системе электропорации. Когда часовая инкубация с аденоассоциированным вирусом будет завершена, вращайте клетки с вирусом при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После того, как надосадочная жидкость будет аспирирована, ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах буфера для ресуспензии клеток, полученного с помощью системы электропорации, на образец.
Затем добавьте 10,8 микролитров рибонуклеопротеинового комплекса на образец и хорошо перемешайте пипеткой, не создавая пузырьков. Теперь вставьте наконечник для электропорации объемом 100 микролитров, нажав на пипетку до второго упора, чтобы открыть зажим. Поместите верхнюю головку пипетки в наконечник электропорации до тех пор, пока зажим надежно не войдет в зацепление с монтажным стержнем поршня.
Постепенно отпускайте кнопку, сохраняя давление на пипетку вниз, чтобы наконечник плотно прилегал к пипетке без зазоров. Затем нажмите на пипетку до первого упора и погрузите наконечник электропорации в клеточную смесь рибонуклеопротеинов. Аккуратно потяните образец вверх в пипетку без пузырьков.
Вставьте пипетку с установленным наконечником для электропорации, содержащим образец, вертикально в Е-пробирку до тех пор, пока не раздастся щелчок. После подтверждения оптимальных настроек регуляторных Т-клеток человека нажмите «Пуск» на сенсорном экране, чтобы электропорировать клетки. Дождитесь завершения отображения сенсорного экрана.
Аккуратно извлеките пипетку и сразу же переложите образец в подготовленную шестилуночную пластину, содержащую 2,5 миллилитров предварительно подогретой без антибиотиков среды RPMI10 с интерлейкином-2 на лунку. После осторожного покачивания планшета линейными движениями поместите его в инкубатор для культуры тканей. На следующий день, через 16-18 часов, замените среду на среду, содержащую антибиотики.
Подсчитайте электропорированные регуляторные Т-клетки и культуру при 10 в степени шести клеток на миллилитр с 1000 международных единиц на миллилитр интерлейкина-2.
