Во время кроветворения гемопоэтические стволовые клетки подвергаются метаболическому переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию. Этот протокол может быть использован для оценки гликолитических и митохондриальных функций гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток мыши. Этот метод может быть использован для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени.
Платформа на основе 96-луночных микропластин обеспечивает высокую пропускную оценку с высокой чувствительностью, что позволяет одновременно анализировать несколько образцов с использованием одной пластины. Этот метод может быть использован для исследования влияния химических веществ или генетических манипуляций на метаболизм HSC в различных условиях. Это может помочь прояснить метаболические пути, которые поддерживают плюрипотентность HSC.
Хотя текущее исследование в основном сосредоточено на гемопоэтических стволовых клетках мышей и клетках-предшественниках, протокол и этот подход могут быть легко адаптированы для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток. За день до анализа откройте комплект для анализа внеклеточного флюса, чтобы удалить картридж датчика и сборку полезной пластины. Сохраните погрузочно-разгрузочные квартиры для использования на следующий день.
Теперь вручную отделите картридж датчика от полезной пластины и поместите его вверх ногами рядом с полезной пластиной. Используя многоканальную пипетку, заполните каждую скважину полезной пластины 200 микролитрами калибранта, включенными в комплект для анализа потока, затем поместите картридж датчика обратно на полезную пластину, убедившись, что датчики полностью погружены в калибрант. Затем инкубируют полезную пластину с калибрантом и собранным картриджем датчика в инкубаторе без углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение ночи после увлажнения, упомянутых в рукописи.
В день анализа готовят 2,5 миллилитра клеточного адгезивного раствора на 96-луночную микропластинку клеточной культуры, как описано в текстовой рукописи. Откройте микропластинку клеточной культуры из 96 лунок, входящую в комплект для анализа флюса, и дозируйте 25 микролитров подготовленного клеточного клеевого раствора на дне каждой лунки. Накройте микропластинкой крышкой и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре внутри вытяжки.
После инкубации удалите и выбросьте избыток клеточного клеевого раствора с помощью многоканальной пипетки или аспиратора и дважды промыть каждую лунку 200 микролитрами стерильной сверхчистой воды. Высушите пластину на воздухе без крышки внутри вытяжки в течение 30-45 минут. Центрифугируйте подготовленные мышей линии отрицательных HSPCs в 200 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре.
После выброса супернатанта повторно суспендируют клеточную гранулу в соответствующей пробирной среде и снова центрифугируют клеточную суспензию. Повторите эту процедуру еще раз и повторно суспендируйте клетки в соответствующей подогретой пробирной среде до концентрации 250 000 клеток на 50 микролитров или пяти миллионов клеток на миллилитры. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 50 микролитров клеточной суспензии вдоль стороны каждой лунки клеточного клея, покрытого 96-луночной микропластиной клеточной культуры, затем добавить 50 микролитров пробирной среды в угловые фоновые измерительные колодцы.
Создайте пластину балансировки центрифуги, добавив 50 микролитров воды на лунку микропластины 96-луночной культуры клеток без покрытия. Центрифугируйте ячейки в 200 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре. Инкубируйте пластину в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25-30 минут для прикрепления клеток.
Через 30 минут визуально подтвердите под микроскопом, что клетки стабильно прилипли к поверхности микропластины. Начните с приготовления всех необходимых растворов в предварительно нагретой среде для анализа гликолизного стресс-теста, как указано в текстовой рукописи, и извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора. Выньте патрон датчика из калибранта и замените его на той же вспомогательной пластине с калибрантом, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Поместите направляющую 80 заряда в верхнюю часть картриджа датчика, ориентируя его так, чтобы буква А располагалась в верхнем левом углу. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 20 микролитров 100-миллимолярного раствора глюкозы в порту A.Замените направляющую загрузки 80 плоской на плоскую направляющую загрузки BC, ориентируя букву B в верхнем левом углу. Дозируйте 22 микролитра 20 микромолярного раствора олигомицина в порту B.Переориентируйте направляющую загрузки BC плоско, чтобы найти букву C в верхнем левом углу для загрузки порта C и дозируйте 25 микролитров 500 миллимолярного 2-дезокси-d-глюкозного раствора в порту C. Затем удалите и выбросьте загрузочный направляющий плоский.
Теперь создайте или загрузите шаблон для нагрузочного теста гликолиза на контроллере. Введите сведения о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а затем нажмите Создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа.
В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации. Для базового измерения и измерений после каждой инъекции установите число циклов измерения равным трем и перемешайте, подождите, измерьте время до трех минут, ноль минут, три минуты. Нажмите кнопку Запустить запуск программного обеспечения.
Снимите крышку с нагруженного и гидратированного картриджа датчика соединений и поместите его на рабочий лоток внеклеточного анализатора потока. Начните выполнение калибровки. Извлеките микропластину, содержащую засеянные клетки, из инкубатора.
Не нарушая клетки, медленно добавляют 130 микролитров предварительно подогретой среды для анализа гликолизного стресс-теста на лунку, чтобы восполнить объем среды в каждой лунке до 180 микролитров и вернуть пластину в инкубатор еще на 15-20 минут. Нажмите кнопку Открыть лоток на программном обеспечении, чтобы открыть тепловой лоток Seahorse. После завершения калибровки замените полезную пластину этой микропластинкой, содержащей ячейки, и нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать измерения.
После того, как измерения завершены, извлеките пробирную среду с пластины, не нарушая клетки, и осторожно промыте их 250 микролитрами фосфатного буферного физиологического раствора, не смещая клетки. Теперь добавьте в каждую лунку 10 микролитров буфера лизиса радиоиммунопреципитации, дополненного коктейлем ингибитора протеазы 1X, и перемешайте пластину на шейкере в течение 10 минут. Заморозьте всю тарелку при минус 80 градусах Цельсия.
Разморозьте пластину и выполните анализ измерения белка для нормализации данных в соответствии с инструкциями производителя. Извлеките и проанализируйте данные, открыв файл данных с помощью настольного программного обеспечения Wave. Нажмите «Нормализовать», вставьте значения нормализации для каждой скважины, а затем нажмите «Применить», чтобы нормализовать данные.
Нажмите «Экспорт» и выберите генератор отчетов о нагрузочных тестах на гликолиз, чтобы экспортировать проанализированные данные в генератор отчетов. Скорость негликолиотического подкисления увеличивается с увеличением числа клеток с 50 000 до 250 000, но увеличивается только минимально между 200 000 и 250 000. Инъекция 10 миллимоляров глюкозы стимулирует гликолиз во всех количествах клеток с максимальным увеличением ЭКАР, наблюдаемым при 250 000 клеток на лунку.
Однако инъекция двух микромоляров олигомицина еще больше не увеличивает ECAR. Данные OCR, полученные в том же наборе стресс-тестов гликолиза, показывают значительное падение после инъекции олигомицина из-за ингибирования комплекса 5. Были рассчитаны параметры нагрузочного теста гликолиза и отобрано 250 000 клеток на лунку в двух микромоляриях олигомицина для дальнейших исследований.
Митохондриальный стресс-тест показал, что две микромолярные инъекции олигомицина вызывают значительное снижение OCR за счет ингибирования комплекса 5. FCCP стимулирует OCR в HSPC дозозависимым образом с максимальным увеличением, наблюдаемым на двух микромолярах. Смесь 0,5 микромолярного ротенона и 0,5 микромолярного антимицина А в инъекции снижает OCR до минимального уровня, соответствующего немитохондриальному потреблению кислорода.
Были рассчитаны параметры митохондриального стресс-теста и выбраны два микромоляра FCCP для дальнейших исследований. Учитывая высокую пропускную способность этого метода, протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для скрининга большого количества биоэнергетических модуляторов в гемопоэтических стволовых клетках, кроветворных предшественниках и злокачественных кроветворных клетках. Анализ морского конька широко используется в литературе для измерения метаболизма в самых разных контекстах в присутствии различных субстратов и ингибиторов.
