Стабильность хранения дополнительных клеточных пузырьков является важным параметром для их перспективного терапевтического использования. Наш протокол предоставляет легко применимый инструмент для оценки того, как хранение влияет на пузырьки. Основным преимуществом нашей техники является то, что, вводя глюкуронидазу в качестве экзогенного маркера, внеклеточные пузырьки, полученные из различных родительских клеток, легко сравниваются с их сторикулой.
Асимметричная фракция потока потока потока, или AF4, является мягкой альтернативой очистке хроматографии размера для очень чувствительных соединений. Потому что соединения сталкиваются с меньшим стрессом в канале. Поскольку глюкуронидаза является чувствительным ферментом, качество проживает выгоды от тщательного планирования и проведения шагов для очистки и анализа спина к спине.
После культивирования клеточной линии интереса в соответствии со стандартными условиями для этих клеток, заменить супернатант с сывороткой свободной или дополнительной клеточной везикулы истощенной среде и вернуть клетки в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных 24 до 72 часов. В конце инкубации, собирать супер natant из каждой колбы и центрифуги образцов осадок клеток. Тщательно соберите клеточной кондиционированной среде, не нарушая гранулы.
И центрифуга среды снова удалить клеточный мусор и большие агрегаты. Затем осторожно перенесите супернатанты в ультрацентрифуговые трубки. При использовании ротора с фиксированным углом отметь ориентацию трубок в центрифуге для облегчения извлечения внеклеточной гранулы везикулы после центрифугации.
В конце ультрацентрифугации используйте серологическую пипетку, чтобы тщательно отказаться от супернатанта, не нарушая внеклеточную гранулу везикулы. На 200 микролитров 0,2 микрометровой поры фильтруют PBS к остаточному супернатанту первой ультрацентрифугной трубки. После повторного перерасхода гранулы, передача в результате внеклеточной подвески пузырьков в следующую трубку для повторного получения последующих гранул до тех пор, пока все внеклеточные гранулы пузырьков были повторно.
Добавьте бета-глюкуронидазу в окончательный раствор гранул с повторной концентрацией 1,5 миллиграмма на миллилитр. И сапонин до конечной концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. Затем хорошо перемешать вихрем в течение трех секунд и поместить реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут с прерывистым нежным стряхивая.
После того, как глюкуронидаза была инкапсулирована, не забудьте выполнить все последующие шаги по оценке везикулы в тот же день, чтобы получить объективные результаты стабильности хранения. Иметь столбец хроматографии размера equilibrated с по крайней мере 2 томами колонки PBS готовы очистить гранулы немедленно после инкубации saponin. Чтобы очистить, добавьте до 400 микролитров внеклеточной подвески везикулы к столбцу.
Затем соберите одну миллилитровую фракцию элуата. Чтобы соответствовать отделению внеклеточных пузырьков от загрязняющих белков и свободной глюкуронидазы, измеряйте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты в соответствии с инструкциями производителей. Используя параметры, оптимизированные для соответствующего инструмента и типа пузырьков, используйте инструмент анализа наночастиц для измерения размера и концентрации внеклеточной везикулы.
Для измерения активности глюкуронидазы добавьте 25 микролитров свежеприготовленного флуоресцента ди-бета-D-глюкуронида в 125 микролитров очищенных внеклеточных пузырьков и добавьте образец в один колодец черной пластины 96-х годов. Измерьте время нулевого производства флуоресцина на считыватель пластин при 480 нанометровом возбуждении и 516 нанометровом выбросе. Накройте пластину плотно прозрачной пластиковой фольгой, чтобы уменьшить испарение.
Затем инкубировать пластину защищены от света в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию. Измерьте 18-часовую выработку флуоресцина на считыватель пластин, как только что продемонстрировано. Для экстрацеллюлярной лиофилизации пузырьков добавьте четыре миллиграмма на миллилитр трегалозы в очищенные пузырьки.
И заморозить пузырьки при температуре минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере один час. Чтобы лиофилизовать образцы, установите температуру полки лиофилия до 15 градусов по Цельсию и давление до 0,180 миллибара. Высушите пузырьки в этих условиях в течение 46 часов.
В конце основного шага сушки установите температуру полки до 25 градусов по Цельсию и давление до 0035 миллибаров и высушите образцы в течение двух часов в этих условиях. Затем храните лиофилизированные образцы при четырех градусах цельсия. Для регидратации образцов после хранения добавьте объем воды, равный объему внеклеточной суспензии пузырьков до лиофилизации.
Чтобы оценить активность фермента после хранения, загрузите прибор AF4 со свежеприготовленным 0,1 микрометром, отфильтрованным PBS для мобильной фазы, и вставьте мембрану фильтра 0,1 микрометра в фильтр пикового вставки после насоса, чтобы уменьшить шум частиц от растворителя. После разборки очистите небольшой канал для AF4 водой millEq. Гидратировать новую регенерированную целлюлозную мембрану с молекулярным весом, отрезанным от 30 килодальтонов, и поместить мембрану поверх лады с блестящей стороной вверх.
Поместите широкий 350-метровый промекать ниже верхней половины канала и собрать части канала. Используя отвертку крутящего момента, затяните винты сначала до крутящего момента в пять ньютонов, затем до крутящего момента в семь ньютонов. Затягивание винтов вокруг блока в крестовом рисунке.
Подключите вход каналов, розетку и порт перекрестного потока к затмению. Затем, по крайней мере, из трех старых образцов, чтобы уравночные мембраны. Программа фракционирование запустить с детектором потока и фокуса потока установлен на один миллилитр в минуту и инъекционный поток 0,2 миллилитров в минуту.
После одной минуты предварительного фокуса шаг, вводить образец в течение 10 минут в фокусе и вводить шаг, прежде чем уменьшить перекрестный поток от двух миллилитров в минуту до 0,1 миллилитров в минуту в течение восьми минут. Закончите фракционирование запустить с шагом элюции без перекрестного потока в течение 10 минут и добавить шаг стирки элюции и инъекции, а затем elution. Затем уравнять канал для следующего запуска с первоначальным перекрестным потоком в два миллилитров в минуту и установить УФ-детектор до 280 нанометров.
Когда все программы будут установлены, введать 300 микролитров образца и записывать УФ и свет рассеяния сигналов в программном обеспечении ASTRA. Через 12 с половиной минут начните собирать одну миллилитровую фракцию до 27 минут после инъекции. Затем выполните анализ глюкуронидазы и анализ отслеживания наночастиц, как это было продемонстрировано.
Здесь показаны восстановление частиц и размер внеклеточных пузырьков, изолированных от сосудистых эндотелиальных клеток человека после семи дней хранения в разных условиях по сравнению со свежим образцом. Везикулы впоследствии подверглись очистке AF4 и была измерена активность глюкуронидазы на частицу. Хроматография исключения размера и AF4 успешны в отделять extracellular vesicle от свободно glucuronidase.
Из-за более высокой степени разделения ДЛЯ AF4 между частицами и свободным ферментом, загрязнение фракций, содержащих пузырьки менее вероятно. Очистка AF4 после хранения удаляет свободный фермент из образцов и, таким образом, снижает количество восстановленной активности фермента на частицу. Этот эффект является наиболее заметным после хранения при четырех градусах по Цельсию, для которых наблюдается снижение на 2/3.
Опуская этот дополнительный шаг очистки может привести к неправильному предположению о стабильности фермента. Передача электронной микроскопии не показывает больших различий в форме для внеклеточных пузырьков лиофилизированы без криопротектора. Сканирование электронной микроскопии изображения, однако, показывает наличие агрегатов в лиофилизированных образцов, которые не находятся в минус 80 градусов хранятся образцы.
Очень важно, чтобы свободный фермент удаляется из пузырьков до анализа глюкуронидазы. Таким образом, методика, используемая для очистки пузырьков, нуждается в тщательной оценке. Очищенные частицы можно также рассматривать с точки зрения их поверхностного заряда, чтобы выяснить, изменило ли хранилище естественный состав мембранных белков или сахаров.
С помощью нашей техники, можно получить первое указание о внеклеточной стабильности хранения пузырьков, даже если Есть нет известных конкретных маркеров или анализов для деятельности доступны.
