Этот протокол позволяет быстро оценить активность NF-kappa-B и AP-1 в макрофагах репортеров, культурных на адсорбных слоях белка, и вклад клеточных сигнальных путей, таких как платные рецепторы, в этот ответ. Основным преимуществом этого метода является его простота, позволяющая быстро анализировать супернатанты клеточной культуры для активности NF-kappa-B и AP-1 с помощью простого энзиматичного анализа. Начните с растворения PMMA в хлороформе при 20 миллиграммах на миллилитр конечной концентрации в 20-миллилитровом стеклянном сцинтилляционном флаконе в дымовом капюшоне.
Поместите магнитный бар перемешать во флаконе, и перемешать смесь, по крайней мере два часа. Когда все твердые тела были растворены, перенесите 400 микролитров раствора PMMA на центр каждого борозиликатного стеклянного микроскопа на запланированное состояние на спиновом пальто и вращайте PMMA на слайде в течение двух минут при 3000 вращениях в минуту. Затем храните слайды со спиновым покрытием в чистой коробке с 70%-ным этанолом.
Далее, в кабинете биологической безопасности, используйте стерильные типсы и асептический метод, чтобы прикрепить восьмикамерные липкие колодцы к PMMA покрытием слайды, нажав твердо на верхней части каждого липкого колодца, чтобы убедиться, что они сильно прикреплены. Позаботьтесь, чтобы выстроить липкие колодцы с краями слайда микроскопа, так что все колодцы прикрепляются к слайду и не протекают. Инкубировать липкие хорошо прикрепленные слайды при 37 градусах по Цельсию на ночь, чтобы обеспечить уплотнения.
Затем добавьте 200 микролитров эндотоксина класса эндотоксинов в каждую колодец для 60-минутной инкубации при комнатной температуре, чтобы проверить тюленей на следующее утро. В конце инкубации, аспирировать воду, заботясь, чтобы не беспокоить покрытие PMMA. Вымойте каждый хорошо три раза с 300 микролитров свежей эндотоксин-свободной воды в течение одного часа за стирку следуют один 12-часовой и один 24-часовой мыть до использования для удаления любого оставшегося растворителя.
Затем УФ стерилизовать слайды в течение 30 минут. Чтобы получить лизоры клеток 3T3, когда клеточные культуры 3T3 достигают 70% слияния в колбы культуры T150, мыть каждую культуру с пятью миллилитров PBS, и лечить клетки с пятью миллилитров животного происхождения, свободной, рекомбинантной фермент диссоциации клеток на колбу при 37 градусах Цельсия в течение трех-пяти минут. В конце инкубации, осторожно наклонить каждую колбу вперед и назад несколько раз, чтобы отделить клетки, прежде чем нейтрализовать фермент с пятью миллилитров PBS на культуру.
Бассейн диссоциированных клеток в одной 50-миллилитровой центрифуг трубки, и использовать пипетку, чтобы разбить любые клетки сгустки. После подсчета, собирать клетки центрифугации. Аспирировать супернатант, и повторно использовать клетки в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации в свежем PBS.
Затем заморозить клетки в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере два часа, пока образец полностью заморожен, прежде чем поместить замороженный раствор клетки в 37-градусной водяной бане по Цельсию до полного размораживания. Для оценки влияния адсорбированных белковых слоя на толл-как рецептор опосредованную активность NF-kappa-B/AP-1, после роста макрофагов репортера в соответствующей по размеру колбе до 70% слияния, отсоедините клетки соответствующим энзиматическим раствором диссоциации, как это было продемонстрировано. Повторное использование клеток в 7,3 раза от 10 до пяти клеток на миллилитр концентрации в среде анализа, и aliquot клетки равномерно между тремя трубками.
Лечить первую трубку клеток с одним микрограммом на миллилитр ингибитора TLR4 в течение 60 минут при комнатной температуре, лечить вторую трубку с 50 микрограммов на миллилитр анти-TLR2 антител в течение 30 минут при комнатной температуре, и оставить третью трубку при комнатной температуре без лечения. В то время как клетки инкубируют, добавьте 200 микролитров лизата и 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота к трем липким скважинам в состоянии. Разрешить белки адсорбировать при 37 градусов по Цельсию в течение соответствующего экспериментального периода, прежде чем аспирировать белковые растворы с новой пипеткой Pasteur для каждой хорошо и мыть липкие поверхности хорошо три раза с 250 микролитров PBS на колодец в течение пяти минут за стирку.
В конце репортер макрофаг лечения, добавить 200 микролитров клеточного раствора для каждой хорошо. Добавьте Pam3CSK4 к окончательной концентрации 150 нанограмм на миллилитр к двум скважинам в качестве положительного контроля TLR2, как показано в схеме. Для положительного контроля TLR4 добавьте липополисахарид к окончательной концентрации 1,5 микрограмма на миллилитр до двух скважин.
После 20 часов при 37 градусах по Цельсию пластина 20 микролитров супернатанта из каждой скважины дублируется в пластине 96 скважин, включая три скважины с 20 микролитров среды анализа на а также фоновый контроль. Затем добавьте 200 микролитров реагента репортеров SEAP в каждую колодец и накройте пластину клеевым уплотнением для инкубации на 2 1/2 часа при 37 градусах по Цельсию. Перенесите оставшуюся часть супернатанта на одну 1,5-миллилитровую трубку на липкую колодец и от осадки мусора центрифугой.
Затем перенесите супернатанты в новые 1,5-миллилитровые трубки для хранения минус 80 градусов по Цельсию для анализа цитокинов ниже по течению ELISA. В конце инкубации снимите клейую печать с пластины и прочитайте абсорбцию на считыватель пластины на 635 нанометров. Замачивание PMMA покрытием микроскоп слайды в 70% этанола в течение одного часа удаляет покрытие PMMA, в то время как ни 70% этанола, ни УФ-стерилизации влияет на угол контакта воды fPTFE покрытием coverslips.
Западный анализ помарки ликатов 3T3 показывает наличие как HMGB1, так и белка теплового шока 60, двух хорошо документированных молекулярных моделей, связанных с повреждением. Адсорбция лигандов TLR из лизата на полимерные поверхности может быть подтверждена культивированием макрофагов репортера в течение 20 часов на белково-адсорбированных полимерных поверхностях, а затем косвенной оценкой активности NF-kappa-B/AP-1 с помощью энзиматической анализа. Эта активность снижается после ингибирования сигнализации TLR2 или TLR4.
Кроме того, макрофаги репортеров значительно увеличили активность NF-kappa-B/AP-1 в ответ на адсорбированную лизат по сравнению с адсорбированной ФБС или плазмой и отсутствием предварительно адсорбированного белка. Кроме того, небольшое количество лизата, разбавленного в сыворотке крови, вызывает значительно повышенные реакции NF-kappa-B/AP-1 по сравнению с сывороткой в одиночку, при этом наименьшее эффективное разбавление зависит от поверхности полимера. Чтобы избежать загрязнения эндотоксином покрытых поверхностей, работа в чистых областях, покрыть поверхности, когда не используется, и использовать клеточной культуры класса воды и буферов для полоскания.
После этой процедуры иммуноанализы могут быть выполнены на оставшихся супернатантах для оценки секреции белка, а макрофаги могут быть проанализированы с помощью цитометрии потока и анализа экспрессии генов qPCR.
