Органоиды, полученные от пациента человека, представляют собой трехмерные модельные системы in vitro, которые представляют как разнообразие пациентов, так и клеточную гетерогенность опухолей. Этот протокол и видеодемонстрация представляют собой подробное практическое руководство по установлению опухоли молочной железы пациента и нормальных органоидов. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, являются захватывающими новыми моделями, но их трудно установить.
Всеобъемлющий протокол, который мы здесь приводим, должен помочь в подготовке исследователей, пытающихся разработать органоиды молочной железы, и ознакомить их с ожидаемыми проблемами. Каждая линия PDO, полученная от другого пациента, уникальна по морфологии и скорости роста. В отличие от двух 2D-систем клеточных линий, органоиды лучше растут при высокой плотности, что обеспечивает лучшее межклеточное взаимодействие.
Продемонстрирует процедуру Диша Аггарвал, аспирант моей лаборатории. Для начала разморозьте бутылку с матрицей базальной мембраны на льду или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Перенесите резецированную ткань в 10-сантиметровую стерильную чашку Петри.
Осмотрите ткань макроскопически и отметьте, кажется ли она морфологически жирной, васкуляризированной или некротической. Кроме того, запишите размер и форму ткани и сфотографируйте ткань с линейкой в поле зрения. Стерильным скальпелем No 10 измельчите ткань на мелкие кусочки и переложите в коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Добавьте 10 миллилитров по два миллиграмма на миллилитр раствора коллагеназы для внутривенного вливания и запечатайте пробирку. Поместите трубку на орбитальный шейкер при температуре 37 градусов Цельсия при 140 об/мин на 30–90 минут под углом 30 градусов. Во время инкубации поместите аликвоту полной среды для предварительного нагрева при температуре 37 градусов Цельсия на бусину или водяную баню.
Каждые 15 минут ресуспендируйте ткань, энергично перемешивая вверх и вниз с помощью пятимиллилитровой стерильной серологической пипетки с предварительно нанесенным покрытием. Отслеживал диссоциацию с течением времени, наблюдая за пробиркой под микроскопом при 5-кратном или более увеличении. После того, как ткань диссоциирована, центрифугируйте при 400 г в течение пяти минут, аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров AdDF + Опять же, центрифугируйте и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, так как тканевые гранулы иногда могут быть рыхлыми.
Если тканевая гранула частично красная, добавьте два миллилитра буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте 10 миллилитров AdDF+ в пробирку, центрифугу при 400 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируют гранулы в 50-300 микролитрах неразбавленной матрицы холодной базальной мембраны и тщательно перемешивают пипеткой, чтобы избежать образования пузырьков.
Используя шестилуночную тарелку для культивирования тканей, которую предварительно нагревают в инкубаторе в течение ночи, накладывают 300 микролитров матричного купола базальной мембраны, содержащего органоиды в каждой лунке. Оставьте пластину нетронутой в вытяжке на пять минут, прежде чем поместить ее при температуре 37 градусов Цельсия на 20–30 минут, чтобы купол матрицы фундаментальной мембраны полностью затвердел. В конце инкубации добавьте три миллилитра предварительно подогретой полной среды по каплям в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
После инкубации сделайте снимки органоидов с помощью объектива 5X на инвертированном светлопольном микроскопе. Поднимите матричный купол базальной мембраны в среду в лунке с помощью клеточного скребка или наконечника пипетки объемом один миллилитр. Используя предварительно покрытый наконечник пипетки, перенесите плавающий купол органоидов со средой в коническую трубку объемом 15 или 50 миллилитров, в зависимости от количества собираемых лунок.
Затем добавьте DPBS, чтобы увеличить объем как минимум до пяти миллилитров. Крутите тюбики при 400 г в течение пяти минут. Матрикс базальной мембраны с органоидами образует слой на дне.
После аспирации надосадочной жидкости добавьте от 5 до 20 миллилитров DPBS, в зависимости от количества лунок, объединенных в трубку. Смешайте гранулы матричной матрицы базоидной мембраны органоида в DBPS с помощью стерильной одноразовой пипетки с предварительно нанесенным покрытием. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
Используя наконечник пипетки с покрытием, добавьте реагент для диссоциации клеток, в три раза превышающий объем матрицы базальной мембраны, и ресуспендируйте органоиды. Поместите трубку на орбитальный шейкер при температуре 37 градусов Цельсия при 140 об/мин на 8–15 минут под углом. Контролируйте пробирку, наблюдая за ней под микроскопом каждые пять минут, чтобы убедиться, что органоиды разбиты на более мелкие кластеры.
Добавьте AdDF+ в объеме, равном или большем, чем реагент для диссоциации клеток, и пипетку для смешивания органоидов. Отжим при 400 г в течение пяти минут до получения органоидной гранулы. Как только будет получена белая органоидная гранула без нерастворенной матрицы базальной мембраны, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре AdDF + Доведите объем до 10 миллилитров с помощью AdDF + Открутите трубку для стадии промывки и выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте необходимое количество матрицы базальной мембраны к переваренным органоидам на основе соответствующего коэффициента расщепления. Перемешайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков, и сразу же положите на лед. Пластинчатые 300-микролитровые купола органоидов, ресуспендированные в матрице базальной мембраны в предварительно разогретой шестилуночной пластине.
Оставьте пластину нетронутой в колпаке на пять минут, прежде чем поместить ее при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа на 20-30 минут, чтобы купола затвердели. По окончании инкубации по три миллилитра предварительно подогретой комплектуйте среду в каждую лунку и поместите тарелку обратно в инкубатор. Добавляйте свежую полную среду каждые пять-семь дней.
Различные органоидные линии опухолей молочной железы, полученные от пациентов, различаются по морфологии и скорости роста. Нормальные органоиды молочной железы и несколько ранних протоковых карцином в органоидах, полученных из C2, напоминали нормальную структуру молочной железы с центральным просветом, окруженным протоковыми клетками. Органоиды, полученные из инвазивной лобулярной карциномы, имеют тенденцию образовывать слабо прикрепленные структуры, похожие на виноградные грозди.
Между тем, органоиды, полученные из инвазивных протоковых карцином, имеют тенденцию образовывать плотные, большие и круглые органоиды. Рост органоидов измеряли с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на третий, шесть, девятый и 12-й дни с базовым показанием на первый день после нанесения покрытия. Здесь показаны изображения яркого поля тех же органоидов, расширенных с течением времени.
Некоторые линии органоидов, полученные от пациентов, имеют время удвоения два дня, в то время как некоторые занимают пять дней. Важно быть терпеливым с конкретными органоидными линиями, которые медленно устанавливаются. По нашему опыту, увеличение плотности покрытия или фильтрация мусора способствует росту PDO.
Органоиды, полученные от пациентов, или PDO, являются отличными моделями для скрининга лекарств. Они моделируют межклеточные, а также межклеточные матричные взаимодействия, которые являются ключом к изучению патофизиологии рака. Кроме того, PDO могут подвергаться генетическим манипуляциям и могут использоваться для разработки ксенотрансплантатов в системах совместного культивирования, что делает их отличными моделями для механистических исследований.
