Этот экспериментальный метод позволяет длительное хранение многоразовых одиночных клеток для эпигеномного тестирования. Это также позволяет анализировать многие эпигенетические метки и факторы транскрипции в одной и той же отдельной клетке. В современных методах анализа одноклеточного эпигенома одни и те же отдельные клетки не могут быть повторно проанализированы.
Однако с многоразовыми одиночными клетками одни и те же отдельные клетки могут быть повторно проанализированы много раз. Этот метод полезен для диагностики и разработки эпигенетической терапии, особенно когда количество клеток пациента ограничено. Этот метод наиболее подходит для изучения эпигенома, регуляции экспрессии генов и других систем, пока доступны специфические антитела для эпигенетических меток.
Когда вы впервые попробуете этот метод, мы рекомендуем вам попрактиковаться на образцах, которые не слишком ценны, и вы проверите эксперимент с помощью неглубокого секвенирования, такого как MiSeq или iSeq 100. Для начала в чистом вытяжном шкафу с ламинарным потоком смешайте один миллилитр клеточной суспензии и 199 миллилитров одного миллимолярного ЭДТА PBS, содержащего интеркаляторный краситель для ДНК. После перемешивания перенесите 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном.
Наденьте крышку на 96-луночную пластину и отсканируйте пластину с помощью сканирующего микроскопа. Затем наклоните пластину и подождите несколько минут, пока одиночная ячейка не опустится до нижнего края лунки. Затем поместите наконечник пипетки в нижний угол и перенесите одну клетку и буфер в пробирку для ПЦР.
Проверьте лунку с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы подтвердить перенос. Если одна клетка все еще находится в лунке, добавьте 200 микролитров на лунку одного миллимолярного ЭДТА PBS, содержащего интеркаляторный краситель для ДНК, и повторите перенос. После переноса наденьте крышку на 96-луночную ПЦР-пластину и центрифугируйте пластину с помощью поворотного ротора без перерыва.
После центрифугирования поместите пластину на палубу автоматического робота для работы с жидкостями. Затем перетащите дополнительный код в окно программного обеспечения робота для обработки жидкостей и запустите программу, чтобы удалить 195 микролитров надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования. Добавьте 50 микролитров 4%-ного TEMED или минерального масла и выдержите тарелку в течение ночи при комнатной температуре.
На следующий день удалите минеральное масло пипеткой и промойте клетки пять раз 200 микролитрами отрицательного буфера TP магния. После последней промывки удалите надосадочную жидкость, добавьте 15 микролитров буфера для отжига и выдержите на льду в течение одного часа. После инкубации поместите пробирки для ПЦР на термоциклер и нагревайте при температуре 94 градуса Цельсия в течение трех минут.
Затем переложите трубки на охлажденный льдом металлический блок и выдерживайте в течение двух минут. Затем добавьте четыре микролитра сульфата магния и хлорида натрия, ДНТП перемешайте и перемешайте вихревом на максимальной скорости. Затем добавьте один микролитр большого фрагмента BST-полимеразы, перемешайте вихревым способом и выдержите в течение четырех часов на шейкере.
После инкубации поместите ПЦР-пробирку в термоциклер и запустите четырехчасовую или ночную программу, как описано в тексте. Для связывания антител добавьте в пробирку 1,625 микролитра раствора хлорида натрия ЭДТА БСА. Перемешайте путем вихряния на низкой скорости и выдержите трубку на льду в течение одного часа.
Затем добавьте 0,1 мкг на миллилитр антитела и контролируйте IgG, конъюгированный с зондом антитела. После добавления антител инкубируйте пробирки на льду легким встряхиванием. На следующий день дважды промойте клетки 200 микролитрами буфера TPM-T на льду.
Затем удалите надосадочную жидкость и один раз промойте буфером ДНК-лигазы Т4. Затем добавьте 19 микролитров раствора адаптера лигирования и выдерживайте в течение одного часа при 25 градусах Цельсия. Затем добавьте один микролитр ДНК-лигазы Т4 и перемешайте пробирку путем вихряния со средней скоростью.
Поместите трубку на термоциклер и запустите программу бесконтактного лигирования. После пробежки дважды промойте клетки 200 микролитрами положительного буфера с отрицательным магнием и ЭДТА и храните клетки в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день дважды промойте клетки 200 микролитрами отрицательного буфера магния ЭДТА и добавьте 20 микролитров смеси, содержащей BST, DNTP и сульфат магния.
Затем перемешайте с помощью вихревого миксера и инкубируйте трубку в течение четырех часов на орбитальном шейкере. После инкубации поместите пробирку на термоциклер и запустите полную программу расширения, как описано в текстовой рукописи. Затем для многократного усиления смещения добавьте 0,4 микролитра 100-микромолярного второго случайного праймера и перемешайте вихревым способом.
Затем инкубируйте трубку в течение двух часов на орбитальном шейкере, прежде чем поместить трубку на термоциклер для нагрева при 94 градусах Цельсия. Через три минуты поместите пробирки в охлажденный льдом металлический блок и добавьте один микролитр ДНК-полимеразы BST. Вращайте трубы с медленной скоростью.
Затем поместите трубки на термоциклер, чтобы запустить программу усиления многократного смещения. После программы перенесите примерно 20 микролитров надосадочной жидкости в пробирку для ПЦР и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем добавьте 20 микролитров 0,05% буфера TWEEN 20 и 0,1X TE в пробирку для ПЦР, содержащую многоразовую одиночную клетку, и инкубируйте пробирку в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
На следующий день соберите надосадочную жидкость и объедините ее с надосадочной жидкостью, собранной ранее. Затем замочите многоразовую одиночную ячейку и буфер TBS, содержащий 50% глицерина, пять миллимоляров ЭДТА, 0,5% BSA и 0,05% TWEEN 20, затем инкубируйте его в течение 30 минут на орбитальном шейкере. После инкубации храните многоразовую одиночную ячейку при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
Наконец, добавьте 40 микролитров основной смеси Exo negative и поместите трубку на термоциклер, чтобы запустить программу, как описано в текстовой рукописи. С использованием этого протокола были сгенерированы многоразовые одиночные ячейки K562. Одиночные клетки встраивали во внешний слой полиакриламидной гранулы и визуализировали с помощью интеркаляторного красителя для окрашивания ДНК.
Здесь показаны продукты ДНК до и после переваривания BciVI. Переваривание рестрикционного фермента генерировало ожидаемые фрагменты от 19 до 20, от 31 до 32, 49 и более 49 пар оснований. Далее сконструированную библиотеку ДНК анализировали методом капиллярного электрофореза для получения желаемых продуктов.
Результаты секвенирования показали, что уникальные картированные показания антигистона H3 ацетилированного лизина 27 и антигистона H3 триметилированного лизина 27 были значительно более многочисленными, чем из контрольного IgG. Сигналы секвенирования REpi оценивались путем сравнения данных секвенирования REpi с данными массового секвенирования ChIP. В среднем, примерно 91% сигналов гистона H3 ацетилированного лизина 27 от секвенирования REpi перекрывались с пиками гистона H-3 ацетилированного лизина 27 при массовом секвенировании ChIP.
Точность секвенирования REpi для неактивной метки гистонов, триметилированного лизина 27 гистона H3, составила 52%Чувствительность секвенирования REpi была проанализирована для измерения того, сколько пиков объемного секвенирования ChIP было обнаружено с помощью воспроизведенных чтений секвенирования REpi. Чувствительность секвенирования REpi составила 55,30% в ацетилированном лизине 27 гистона H3 и 50,94% в триметилированном лизине 27 гистона H3. Пожалуйста, убедитесь, что вы используете реагенты, не содержащие DNS.
Кроме того, все операции, связанные с открытием проводов трубок или выводов реагентов, должны выполняться в чистом колпаке. Продукты ДНК этой процедуры секвенируются, а затем сопоставляются с геномом, чтобы выявить, какие модификации гистонов присутствуют, в каких областях генома в отдельных клетках. Эта технология позволила проанализировать несколько эпигенетических меток в одной и той же клетке и проложила путь к мультиомному анализу в любой отдельной клетке.
