Сердечно-сосудистая неисправность является основной причиной смерти во всем мире. Изолированная модель сердца, которую мы представляем здесь, может служить экспериментальным окном в сердечную динамику человека. Этот подход сочетает в себе классическое электрофизиологическое исследование с одновременным оптическим картированием трансмембранного напряжения и межклеточного кальция для оценки состояния сердца.
Эта методология может быть применена к моделированию заболеваний, фармакологии и токсикологии исследований. Например, одной из наших областей внимания является характеристика влияния размеров стекла на сердечную электрофизиологию. Хотя эта методология является более технически сложной, чем протокол, который использует меньшую модель животных, в целом, протокол является относительно простым, как только все части на месте.
Трудно описать все компоненты системы визуализации и перфузии по тексту, поэтому визуальная демонстрация этого процесса поможет в воспроизведении успешной подготовки. Изолировав сердце восходящей аортой, окунив вырезанный орган в ледяную кардиоплегию и используйте пару гемостатов, чтобы схватить стену аорты. Проскользните сосуд на ребристую канюлю, прикрепленную к трубе, подключенную к одному литру ледяной кардиоплегии среды, подвешенной примерно на 95 сантиметров над сердцем.
Разрешить жидкости для заполнения аорты, пока сосуд переполнения, чтобы предотвратить любые пузырьки от входа в сосуды и использовать пуповинной лентой для обеспечения аорты к канюле. Свяжите гемостаты, чтобы нести вес сердца, как он висит от канюлы для дальнейшей защиты ткани и позволяют холодной среде ретроградной perfuse сердце при постоянном давлении 70 миллиметров ртути под действием силы тяжести. Перенесите слышть на 37 градусов по Цельсию Langendorff системы без введения воздуха в канюлю.
И позволить нормальному синусовому ритму промыть сосуды любой оставшейся крови и кардиоплегии. В случае шоковой аритмии, поместите внешние весла на вершину и основание сердца, чтобы дефибрилляции органа, обеспечивая один шок на пять джоулей и увеличение в пять джоулей шагом до 50 джоулей, кардиоверсия, или unshockable ритм достигается. Затем, промыть сердце, по крайней мере один литр модифицированных Кребс-Хенселейт среды без рециркуляции, чтобы удалить остатки крови и кардиоплегии.
Когда среда проходит ясно через сердце, закройте циркулирующую петлю, чтобы рециркуляции перфусировать. Чтобы записать стандартный результат ЭКГ на протяжении всего исследования, прикрепите электрод иглы 29-го калибра к желудочковому эпикардию вблизи вершины и прикрепите еще один электрод в правом атриуме. Подключите положительные и отрицательные входы дифференциального биоамплификатора к вершине и правому атриуму, соответственно, и прикрепите один биполярный электрод стимула на правом атриуме и второй биполярный электрод стимула к боковому левому желудоку для целей ходить.
Пейс сердце с помощью электрофизиологического стимулятора, с первоначальным током установлен в два раза диастолический порог и одна миллисекундная ширина пульса. Чтобы определить порог темпа, примените ряд импульсов стимулов от одного до двух миллиампер с шириной импульса в одну миллисекунду при определенных длинах цикла темпа, чтобы обеспечить последовательную реакцию стимула. Выполните дополнительный стимул ходить с помощью либо S1, S1 или S1, S2 ходить поезд.
Уменьшите цикл темпа S2 пошаговую длину на 10 миллисекунд до тех пор, пока темп не сможет захватить. Затем подойти к предпоследней длине цикла темпа и уменьшить длину цикла в один миллисекундный интервал, чтобы определить наиболее точную длину цикла темпа до потери захвата. Чтобы установить желудочковый эффективный огнеупорный период, используйте стимул электрода на боковой левый желудочек, чтобы определить кратчайший S1, S2 интервал, с которым S2 преждевременного бить инициирует желудочковой деполяризации.
Чтобы определить длину цикла Wenckebach, используйте стимул электрод на правом атриуме, чтобы найти кратчайший интервал S1, S1, с которым один-к-одному атриовентрикулярной проводимости распространяется через нормальный путь проводимости. Чтобы определить время восстановления синусового узла, используйте стимул электрода на правом предсердии, чтобы применить S1, S1 ходить поезд и измерить задержку времени между последним импульсом в ходить поезд и восстановление спонтанного синоатриального узла опосредовано деятельности. Для установления атриовентрикулярного узла эффективный огнеупорный период, используйте стимул электрод на правом атриуме.
Найдите кратчайший интервал соединения S1, S2, с помощью которого за преждевременной стимуляцией предсердий следует hisbundle потенциал, который вызывает комплекс SRS, означающий деполяризацию желудочков. Для оптического картирования трансмембранного напряжения и внутриклеточного кальция, сначала медленно добавить до пяти миллилитров свежеприготовленного красителя напряжения проксимальной аортальной канюли с последующим медленным добавлением свежеприготовленного красителя кальция. Далее распоите оборудование для визуализации, чтобы сосредоточиться на соответствующем поле зрения и подключить камеру к рабочей станции.
Приобретайте изображения с помощью выбранного программного обеспечения со временем экспозиции от 5 до 2 миллисекунд. И выполнить выравнивание изображения с помощью программного обеспечения, которое может разделить и наложить желаемые регионы и отображать вычитание серой шкалы или псевдоцветное дополнение к любым несогласованно. С окружающим освещением сведено к минимуму, проверить светодиодные фонари, чтобы обеспечить равномерное и максимальное эпикардиального освещения, как это определено датчиком хорошо глубины.
Затем, изображение миокарда во время синусового ритма, фибрилляции желудочков, или динамический темп с помощью стимула электрода, расположенный на левом желудочковом, начиная с ходить цикл длиной 350 миллисекунд и уменьшается на 10 до 50 миллисекунд для создания кривых реституции. Чтобы подтвердить получение оптического сигнала качества на протяжении всего эксперимента, откройте видеофейль, выберите область интереса и навеяете среднее флуоресценцию с течением времени. В конце эксперимента удалите сердце из системы и слейте перфусат.
Затем промойте системные трубы и камеры очищенной водой. Для регулярного технического обслуживания периодически прополощите систему раствором моющего средства по мере необходимости. В этих репрезентативных исследованиях, процедура была выполнена на нетронутых моделях, как было попродемонстрировано, которые варьировались в размерах от 2,5 до 10,5 кг массы тела и от 18 до 137 граммов массы сердца.
После переноса изолированного сердца в систему Лангендорфа, пульс стабилизируется примерно до 70 ударов в минуту в течение примерно 10 минут дефибрилляции и остается постоянным на протяжении всего исследования. Средняя скорость потока около 184 миллилитров в минуту, как правило, измеряется. Он замедляется до 70 миллилитров в минуту после перфузирования с разогретой средой, содержащей механический uncoupler.
Свинец два ЭКГ могут быть записаны в течение всего исследования во время синусового ритма или в ответ на внешние темпы количественно электрофизиологических параметров. Эксперименты по оптическому картированию также могут проводиться во время синусового ритма и спонтанной фибрилляции желудочков. Репрезентативные изображения нагруженного красителем сердца могут быть получены с соответствующими оптическими потенциалами действия.
И кальций переходных могут быть собраны из двух областей, представляющих интерес на эпикардиальной поверхности. Кроме того, динамический эпикардиальный темп может быть использован во время оптических картографических экспериментов для нормализации любых незначительных различий в внутренней сердечной ставки. Необработанные сигналы могут быть использованы для изображения потенциального действия кальция переходного времени соединения, активации и продолжительности времени, а также электрической и кальция реституции.
Важно не позволять пузырькам проникать в аорту, минимизировать время перехода от животного к системе, а также поддерживать более крупное сердце. Электрофизиология и данные оптического сигнала могут быть проанализированы после приобретения. Кроме того, сердце может быть сохранено после исследования гистологии, иммуностимулятора или анализа экспрессии генов.
Мы используем этот метод для характеристики развития сердца несовершеннолетних и изучения влияния воздействия на окружающую среду сердечной физиологии. Механические разъединения, используемые для минимизации движения и анти-пены химических веществ, используемых для решения альбумин вспенивание являются токсичными, поэтому с помощью соответствующего средства индивидуальной защиты является абсолютно необходимым.
