Herz-Kreislauf-Störungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Das isolierte Herzmodell, das wir hier präsentieren, kann als experimentelles Fenster in die menschliche Herzdynamik dienen. Dieser Ansatz kombiniert eine klassische elektrophysiologische Studie mit der gleichzeitigen optischen Kartierung von Transmembranspannung und interzellulärem Kalzium, um den Zustand des Herzens zu bewerten.
Diese Methode kann auf Krankheitsmodellierung, Pharmakologie und toxikologische Studien angewendet werden. Einer unserer Schwerpunkte ist beispielsweise die Charakterisierung der Auswirkungen von Glassizern auf die Herzelektrophysiologie. Obwohl diese Methode technisch anspruchsvoller ist als ein Protokoll, das ein kleineres Tiermodell verwendet, ist das Protokoll insgesamt relativ einfach, sobald alle Teile vorhanden sind.
Es ist schwierig, alle Komponenten eines Bildgebungs- und Perfusionssystems durch Text zu beschreiben, daher hilft die visuelle Demonstration dieses Prozesses bei der Reproduktion einer erfolgreichen Vorbereitung. Nachdem Sie das Herz mit der aufsteigenden Aorta intakt isoliert haben, tauchen Sie das ausgeschnittene Organ in eiskalte Kardioplegie und greifen sie mit einem Paar Hämostaten an die Wand der Aorta. Schieben Sie das Gefäß auf eine gerippte Kanüle, die an Schläuchen befestigt ist, die mit einem Liter eiskaltem Cardioplegiemedium verbunden sind, das etwa 95 Zentimeter über dem Herzen schwebt.
Lassen Sie die Flüssigkeit die Aorta füllen, bis das Gefäß überläuft, um zu verhindern, dass Blasen in die Vaskulatur eindringen, und verwenden Sie Nabelband, um die Aorta an der Kanüle zu sichern. Binden Sie die Hämostate, um das Gewicht des Herzens zu tragen, wie es von der Kanüle hängt, um das Gewebe weiter zu sichern und das kalte Medium zu retrograd das Herz bei einem konstanten Druck von 70 Millimeter Quecksilber durch die Schwerkraft durchdringen lassen. Übertragen Sie das Hören auf das 37 Grad Celsius Langendorff-System, ohne Luft in die Kanüle zu bringen.
Und lassen Sie den normalen Sinus-Rhythmus die Vaskulatur des verbleibenden Blutes und Der Kardioplegie spülen. Im Falle von stoßbaren Arrhythmien, platzieren Sie externe Paddel an der Spitze und Basis des Herzens, um die Orgel zu schwächen, liefert einen einzigen Schock bei fünf Joule und erhöht sich in fünf Joule-Schritten, bis 50 Joule, Kardioversion oder unschockable Rhythmus erreicht wird. Dann spülen Sie das Herz mit mindestens einem Liter modifiziertem Krebs-Henseleit-Medium ohne Rezirkulation, um Restblut und Kardioplegie zu entfernen.
Wenn das Medium klar durch das Herz läuft, schließen Sie die Zirkulusschleife, um die Perfusate zu rezirkulieren. Um eine Standard-Leitung zu EKG während des gesamten Studiums aufzuzeichnen, befestigen Sie eine 29-Spur-Nadelelektrode an das ventrikuläre Epikardie in der Nähe der Spitze und befestigen Sie eine weitere Elektrode im rechten Atrium. Schließen Sie die positiven und negativen Eingänge eines Differential-Bioverstärkers an den Scheitelpunkt bzw. das rechte Atrium an und befestigen Sie eine bipolare Stimuluselektrode am rechten Atrium und eine zweite bipolare Stimuluselektrode zum Tempoieren an den seitlichen linken Ventrikel.
Beschleunigen Sie das Herz mit einem elektrophysiologischen Stimulator, wobei der Anfangsstrom auf das Doppelte der diastolischen Schwelle und eine Pulsbreite von einer Millisekunde eingestellt ist. Um den Temposchwellenwert zu identifizieren, wenden Sie eine Reihe von Ein- bis Zwei-Milliamp-Impulsimpulsen mit einer Pulsbreite von einer Millisekunde bei definierten Tempozykluslängen an, um eine konsistente Stimulusreaktion zu gewährleisten. Führen Sie zusätzlicheStimulus-Schrittmitmitfahren mit einem Schrittzug S1, S1 oder S1, S2 durch.
Verringern Sie die S2-Schrittzykluslänge schrittweise um 10 Millisekunden, bis das Tempo nicht erfasst werden kann. Treten Sie dann auf die vorletzte Schrittzykluslänge auf und verringern Sie die Zykluslängen in Intervallen von einer Millisekunde, um die genaueste Schrittzykluslänge vor dem Verlust der Erfassung zu bestimmen. Um die ventrikuläre effektive Feuerfestperiode zu bestimmen, verwenden Sie die Reizelektrode auf dem seitlichen linken Ventrikel, um das kürzeste S1-, S2-Intervall zu identifizieren, bei dem der vorzeitige S2-Beat eine ventrikuläre Depolarisation initiiert.
Um die Wenckebach-Zykluslänge zu definieren, verwenden Sie die Reizelektrode auf dem rechten Atrium, um das kürzeste S1-S1-Intervall zu finden, bei dem sich eine eins-zu-eins-atrioventrikuläre Leitung über den normalen Leitungsweg ausbreitet. Um die Sinusknoten-Wiederherstellungszeit zu definieren, verwenden Sie die Stimuluselektrode auf dem rechten Atrium, um einen S1, S1-Schrittzug anzuwenden und die Zeitverzögerung zwischen dem letzten Impuls im Schrittzug und der Wiederherstellung spontaner sinoatrialer Knoten-vermittelte Aktivität zu messen. Um die atrioventrikuläre Knoten effektive Feuerfestperiode zu etablieren, verwenden Sie die Reizelektrode auf dem rechten Atrium.
Finden Sie das kürzeste S1- s2-Kopplungsintervall, bei dem auf die vorzeitige Vorhofstimulation ein Hisbundle-Potenzial folgt, das einen QRS-Komplex auslöst, was eine ventrikuläre Depolarisation bedeutet. Für die optische Kartierung der Transmembranspannung und des intrazellulären Kalziums werden zunächst langsam bis zu fünf Milliliter frisch präparierter Spannungsfarbstoff proximal zur Aortenkanüle addiert, gefolgt von der langsamen Zugabe von frisch zubereitetem Calciumfarbstoff. Positionieren Sie als Nächstes die Bildverarbeitungshardware, um sich auf ein geeignetes Sichtfeld zu konzentrieren, und schließen Sie die Kamera an eine Arbeitsstation an.
Erfassen Sie Bilder mit der ausgewählten Software mit einer Belichtungszeit von 5 bis zwei Millisekunden. Und führen Sie eine Bildausrichtung mit Hilfe von Software, die die gewünschten Bereiche teilen und überlagern und eine Graustufensubtraktion oder Pseudo-Farbaddition zu allen Hervorhebungsfehlern anzeigen kann. Wenn die Umgebungsbeleuchtung minimiert ist, testen Sie die LED-Leuchten, um eine gleichmäßige und maximale Epikardialebeleuchtung zu gewährleisten, wie durch die Brunnentiefe des Sensors bestimmt wird.
Dann bilde das Myokard während des Sinusrhythmus, des Kammerflimmerns oder des dynamischen Tempos mit der Stimulationselektrode, die auf dem linken Ventrikel positioniert ist, beginnend mit einer Schrittzykluslänge von 350 Millisekunden und einer Verringerung um 10 bis 50 Millisekunden, um Restitutionskurven zu erzeugen. Um den Erwerb eines optischen Qualitätssignals während des gesamten Experiments zu bestätigen, öffnen Sie eine Videodatei, wählen Sie einen Interessenbereich aus, und zeichnen Sie die mittlere Fluoreszenz im Laufe der Zeit. Am Ende des Experiments, entfernen Sie das Herz aus dem System und entleeren Sie die Perfusate.
Dann spülen Sie die Systemschläuche und Kammern mit gereinigtem Wasser. Für die routinemäßige Wartung spülen Sie das System bei Bedarf regelmäßig mit Waschmittellösung ab. In diesen repräsentativen Studien wurde das Verfahren an intakten Modellen durchgeführt, wie gezeigt, die in der Größe von 2,5 bis 10,5 Kilogramm Körpergewicht und 18 bis 137 Gramm Herzgewicht reichten.
Nach der Übertragung des isolierten Herzens auf ein Langendorff-System stabilisiert sich die Herzfrequenz innerhalb von ca. 10 Minuten Defibrillation auf etwa 70 Schläge pro Minute und bleibt während der gesamten Studiendauer konstant. In der Regel wird ein durchschnittlicher Durchfluss von ca. 184 Milliliter pro Minute gemessen. Es verlangsamt sich auf 70 Milliliter pro Minute, nachdem es mit einem erwärmten Medium, das einen mechanischen Entkoppler enthält, durchdringend wird.
Blei zwei EKGs können während der gesamten Dauer der Studie während des Sinusrhythmus oder als Reaktion auf externes Tempo aufgezeichnet werden, um die elektrophysiologischen Parameter zu quantifizieren. Optische Kartierungsexperimente können auch während des Sinusrhythmus und des spontanen Kammerflimmerns durchgeführt werden. Repräsentative Bilder eines mit Farbstoff belasteten Herzens können mit den entsprechenden optischen Wirkungspotentialen erhalten werden.
Und Kalziumtransienten können aus zwei Regionen von Interesse auf der Epikardenoberfläche gesammelt werden. Darüber hinaus kann während der optischen Kartierungsexperimente dynamisches Epikardial-Pacing verwendet werden, um geringfügige Unterschiede in den intrinsischen Herzfrequenzen zu normalisieren. Die Rohsignale können verwendet werden, um das Aktionspotential der transienten Kopplungszeit Calcium, die Aktivierungs- und Dauerzeit sowie die elektrische und Kalziumrestitution darzustellen.
Es ist wichtig zu vermeiden, dass Blasen in die Aorta gelangen, die Zeit des Transfers vom Tier zum System zu minimieren und das größere Herz zu unterstützen. Elektrophysiologie und optische Signaldaten können nach der Erfassung analysiert werden. Zusätzlich kann das Herz nach der Studie für Histologie, Immunostainierung oder Genexpressionsanalyse erhalten bleiben.
Wir verwenden diese Technik, um die entwicklung der jugendlichen Herzkardina zu charakterisieren und die Auswirkungen von Umweltbelastungen auf die Herzphysiologie zu untersuchen. Die mechanischen Entkoppler, die zur Minimierung von Bewegungen verwendet werden, und die Antischaumchemikalien, die verwendet werden, um Albumin-Schaum zu adressieren, sind beide giftig, daher ist die Verwendung der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung absolut notwendig.
