O mau funcionamento cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. O modelo cardíaco isolado que apresentamos aqui pode servir como uma janela experimental para a dinâmica cardíaca humana. Esta abordagem combina um estudo de eletrofisiologia clássica com o mapeamento óptico simultâneo da tensão transmembrana e do cálcio intercelular para avaliar o estado do coração.
Essa metodologia pode ser aplicada a estudos de modelagem de doenças, farmacologia e toxicologia. Por exemplo, uma de nossas áreas de foco é caracterizar os efeitos dos dimensionadores de vidro na eletrofisiologia cardíaca. Embora essa metodologia seja mais tecnicamente desafiadora do que um protocolo que utiliza um modelo animal menor, no geral, o protocolo é relativamente simples uma vez que todas as peças estão em vigor.
É difícil descrever todos os componentes de um sistema de imagem e perfusão por texto, então a demonstração visual desse processo ajudará a reproduzir uma preparação bem sucedida. Depois de isolar o coração com a aorta ascendente intacta, mergulhe o órgão excisado em cardioplegia gelada e use um par de hemostatas para segurar a parede da aorta. Coloque o recipiente em uma cânula costelada presa a tubos ligados a um litro de meio cardioplegia gelado suspenso aproximadamente 95 centímetros acima do coração.
Deixe o fluido encher a aorta até que o vaso transborde para evitar que quaisquer bolhas entrem na vasculatura e use fita umbilical para fixar a aorta na cânula. Amarre os hemostatos para suportar o peso do coração enquanto ele fica pendurado na cânula para proteger ainda mais o tecido e permitir que o meio frio para retrógrado perfume o coração a uma pressão constante de 70 milímetros de mercúrio pela gravidade. Transfira a ouvir para o sistema Langendorff Celsius de 37 graus sem introduzir ar na cânula.
E permita que o ritmo sinusal normal dê descarga na vasculatura de qualquer sangue e cardioplegia restantes. Em caso de arritmias chocantes, coloque pás externas no ápice e na base do coração para desfibrilar o órgão, proporcionando um único choque em cinco joules e aumentando em cinco incrementos de joule até que 50 joules, cardioversão ou ritmo inalhockr é alcançado. Em seguida, lave o coração com pelo menos um litro de meio Krebs-Henseleit modificado sem recirculação para remover qualquer sangue residual e cardioplegia.
Quando o meio correr livre pelo coração, feche o laço circulante para recircular o perfusado. Para registrar uma pista padrão ao ECG ao longo do estudo, conecte um eletrodo de agulha de 29 bitolas ao epicardium ventricular perto do ápice e conecte outro eletrodo no átrio direito. Conecte os insumos positivos e negativos de um bioamplificador diferencial ao ápice e ao átrio direito, respectivamente, e conecte um eletrodo de estímulo bipolar no átrio direito e um segundo eletrodo de estímulo bipolar ao ventrículo esquerdo lateral para fins de sossega.
Acelere o coração usando um estimulador de eletrofisiologia, com a corrente inicial definida para o dobro do limiar diastólico e uma largura de pulso de um milissegundo. Para identificar o limiar de ritmo, aplique uma série de impulsos de estímulo de um a dois miliamperes com uma largura de pulso de um milissegundo em comprimentos de ciclo de ritmo definidos para garantir uma resposta consistente de estímulo. Realize um ritmo de estímulo extra usando um trem de ritmo S1, S1 ou S1, S2.
Diminua o comprimento do ciclo de ritmo S2 em 10 milissegundos até que o ritmo não capture. Em seguida, pise até o penúltimo comprimento do ciclo de ritmo e diminua os comprimentos de ciclo em intervalos de um milissegundo para determinar o comprimento mais preciso do ciclo de ritmo antes da perda da captura. Para estabelecer o período refratário ventricular efetivo, utilize o eletrodo de estímulo no ventrículo esquerdo lateral para identificar o intervalo S1, S2 mais curto em que a batida prematura S2 inicia a despolarização ventricular.
Para definir o comprimento do ciclo de Wenckebach, use o eletrodo de estímulo no átrio direito para encontrar o intervalo S1, S1 mais curto em que uma condução atrioventricular de um para um se propaga através da via de condução normal. Para definir o tempo de recuperação do nó sinusal, use o eletrodo de estímulo no átrio direito para aplicar um trem de ritmo S1, S1 e medir o atraso de tempo entre o último impulso no trem de ritmo e a recuperação da atividade mediada do nódulo sinoatrial espontâneo. Para estabelecer o nódulo arioventricular efetivo período refratário, use o eletrodo de estímulo no átrio direito.
Encontre o intervalo de acoplamento S1, S2 mais curto no qual a estimulação atrial prematura é seguida por um potencial hisbundle que provoca um complexo QRS, significando despolarização ventricular. Para o mapeamento óptico da tensão transmembrana e do cálcio intracelular, primeiro adicione lentamente cinco mililitros de corante de tensão recém-preparado proximal à cânula aórtica seguida pela adição lenta de corante de cálcio recém-preparado. Em seguida, posicione o hardware de imagem para se concentrar em um campo de visão apropriado e conectar a câmera a uma estação de trabalho.
Adquira imagens usando o software selecionado com um tempo de exposição de 5 a dois milissegundos. E realize um alinhamento de imagem com o auxílio de um software que pode dividir e sobrepor as regiões desejadas e exibir uma subtração em escala de cinza ou adição pseudocolorida a quaisquer desalinhamentos de destaque. Com a iluminação ambiente minimizada, teste as luzes LED para garantir uma iluminação épica uniforme e máxima, conforme determinado pela profundidade do sensor.
Em seguida, imagem do miocárdio durante o ritmo sinusal, fibrilação ventricular ou ritmo dinâmico usando o eletrodo de estimulação posicionado no ventrículo esquerdo, começando com um comprimento de ciclo de ritmo de 350 milissegundos e diminuindo em 10 a 50 milissegundos para gerar curvas de restituição. Para confirmar a aquisição de um sinal óptico de qualidade durante todo o experimento, abra um arquivo de vídeo, selecione uma região de interesse e plote a fluorescência média ao longo do tempo. No final do experimento, remova o coração do sistema e drene o perfusado.
Em seguida, enxágue o tubo do sistema e as câmaras com água purificada. Para manutenção de rotina, enxágue periodicamente o sistema com solução de detergente conforme necessário. Nesses estudos representativos, o procedimento foi realizado em modelos intactos, como demonstrado, que variaram em tamanho de 2,5 a 10,5 kg de peso corporal e 18 a 137 gramas de peso cardíaco.
Depois de transferir o coração isolado para um sistema Langendorff, a frequência cardíaca estabiliza-se para cerca de 70 batimentos por minuto dentro de aproximadamente 10 minutos de desfibrilação e permanece constante durante toda a duração do estudo. Uma taxa média de fluxo de aproximadamente 184 mililitros por minuto é tipicamente medida. Ele desacelera para 70 mililitros por minuto depois de perfusar com meio aquecido contendo um desacoplador mecânico.
Os ECGs de chumbo podem ser registrados ao longo da duração do estudo durante o ritmo sinusal ou em resposta ao ritmo externo para quantificar os parâmetros eletrofisiológicos. Experimentos de mapeamento óptico também podem ser realizados durante o ritmo sinusal e fibrilação ventricular espontânea. Imagens representativas de um coração carregado de corante podem ser obtidas com os potenciais de ação óptica correspondentes.
E transitórios de cálcio podem ser coletados de duas regiões de interesse na superfície epicárardial. Além disso, o ritmo épico dinâmico pode ser usado durante os experimentos de mapeamento óptico para normalizar quaisquer pequenas diferenças nas frequências cardíacas intrínsecas. Os sinais brutos podem ser usados para retratar o tempo de acoplamento transitório de cálcio potencial de ação, o tempo de ativação e duração, e a restituição elétrica e de cálcio.
É importante evitar permitir que bolhas entrem na aorta, minimizar o tempo de transferência do animal para o sistema, e apoiar o coração maior. Os dados de eletrofisiologia e sinal óptico podem ser analisados após a aquisição. Além disso, o coração pode ser preservado após o estudo para histologia, imunostaining ou análise de expressão genética.
Estamos usando essa técnica para caracterizar o desenvolvimento cardíaco juvenil e examinar o impacto das exposições ambientais na fisiologia cardíaca. Os desacopladores mecânicos usados para minimizar o movimento e os produtos químicos anti-espuma usados para lidar com espuma de albumina são ambos tóxicos, por isso o uso do equipamento de proteção individual apropriado é absolutamente essencial.
