Il malfunzionamento cardiovascolare è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il modello cardiaco isolato che presentiamo qui può servire come finestra sperimentale sulla dinamica cardiaca umana. Questo approccio combina uno studio di elettrofisiologia classica con la mappatura ottica simultanea della tensione transmembrana e del calcio intercellulare per valutare lo stato del cuore.
Questa metodologia può essere applicata agli studi di modellazione delle malattie, farmacologia e tossicologia. Ad esempio, una delle nostre aree di interesse è caratterizzare gli effetti dei taglia vetro sull'elettrofisiologia cardiaca. Sebbene questa metodologia sia più tecnicamente impegnativa di un protocollo che utilizza un modello animale più piccolo, nel complesso, il protocollo è relativamente semplice una volta che tutti i pezzi sono in atto.
È difficile descrivere tutti i componenti di un sistema di imaging e perfusione per testo, quindi la dimostrazione visiva di questo processo aivierà a riprodurre una preparazione di successo. Dopo aver isolato il cuore con l'aorta ascendente intatta, immergere l'organo asportato nella cardioplegia ghiacciata e usare un paio di emostati per afferrare la parete dell'aorta. Infilare il vaso su una cannula a coste attaccata a tubi collegati a un litro di mezzo cardioplegia ghiacciato sospeso a circa 95 centimetri sopra il cuore.
Lasciare che il fluido riempia l'aorta fino a quando il recipiente trabocca per evitare che eventuali bolle entrino nella vascuola e utilizzare nastro ombelicale per fissare l'aorta alla cannula. Legare gli emostati per sopportare il peso del cuore mentre pende dalla cannula per fissare ulteriormente il tessuto e consentire al mezzo freddo di retrogradare perfondendo il cuore a una pressione costante di 70 millimetri di mercurio per gravità. Trasferire l'udizione al sistema Langendorff di 37 gradi Celsius senza introdurre aria nella cannula.
E permettere al normale ritmo del seno di sciacquare la vascucolatura di tutto il sangue e la cardioplegia rimanenti. In caso di aritmie shockable, posizionare le pagaie esterne all'apice e alla base del cuore per defibrillare l'organo, offrendo un singolo shock a cinque joule e aumentando in cinque incrementi joule fino a raggiungere 50 joule, cardioversione o ritmo non sganciabile. Quindi, sciacquare il cuore con almeno un litro di mezzo Krebs-Henseleit modificato senza ricircolo per rimuovere sangue residuo e cardioplegia.
Quando il mezzo scorre limpido attraverso il cuore, chiudere il ciclo circolante per ricircolare il perfusato. Per registrare un piombo standard all'ECG durante tutto il corso dello studio, attaccare un elettrodo ad ago calibro 29 all'epicardio ventricolare vicino all'apice e attaccare un altro elettrodo nell'atrio destro. Collegare gli ingressi positivi e negativi di un bioamplificatore differenziale rispettivamente all'apice e all'atrio destro e attaccare un elettrodo di stimolo bipolare sull'atrio destro e un secondo elettrodo di stimolo bipolare al ventricolo sinistro laterale per scopi di stimolazione.
Cammina il cuore usando uno stimolatore di elettrofisiologia, con la corrente iniziale impostata sul doppio della soglia diastolica e una larghezza dell'impulso di un millisecondo. Per identificare la soglia di stimolazione, applicare una serie di impulsi di stimolo da uno a due milliamp con una larghezza dell'impulso di un millisecondo a lunghezze del ciclo di stimolazione definite per garantire una risposta di stimolo coerente. Eseguire stimolazione extra utilizzando un treno di stimolazione S1, S1 o S1, S2.
Ridurre la lunghezza del ciclo di stimolazione S2 in modo graduale di 10 millisecondi fino a quando il ritmo non riesce a catturare. Quindi, sali alla penultima lunghezza del ciclo di stimolazione e riduci le lunghezze del ciclo in intervalli di un millisecondo per determinare la lunghezza del ciclo di stimolazione più precisa prima della perdita di cattura. Per stabilire il periodo refrattario efficace ventricolare, utilizzare l'elettrodo di stimolo sul ventricolo sinistro laterale per identificare l'intervallo S1, S2 più breve in cui il battito prematuro S2 inizia la depolarizzazione ventricolare.
Per definire la lunghezza del ciclo di Wenckebach, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo S1, S1 più breve in cui una conduzione atrioventricolare uno a uno si propaga attraverso la normale via di conduzione. Per definire il tempo di recupero del nodo del seno, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per applicare un treno di stimolazione S1, S1 e misurare il ritardo di tempo tra l'ultimo impulso nel treno di stimolazione e il recupero dell'attività mediata spontanea del nodo sinoatriale. Per stabilire il periodo refrattario effettivo del nodo atrioventricolare, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro.
Trova l'intervallo di accoppiamento S1, S2 più breve in cui la stimolazione atriale precoce è seguita da un potenziale hisbundle che suscita un complesso QRS, che significa depolarizzazione ventricolare. Per la mappatura ottica della tensione transmembrana e del calcio intracellulare, aggiungere prima lentamente fino a cinque millilitri di colorante di tensione appena preparato prossimale alla cannula aortica seguito dalla lenta aggiunta di colorante di calcio appena preparato. Quindi, posizionare l'hardware di imaging per concentrarsi su un campo visivo appropriato e collegare la fotocamera a una workstation.
Acquisire immagini utilizzando il software selezionato con un tempo di esposizione da 5 a due millisecondi. Ed eseguire un allineamento dell'immagine con l'aiuto di software in grado di dividere e sovrapporre le regioni desiderate e visualizzare una sottrazione in scala di grigi o un'aggiunta pseudo-colore a eventuali disallineamenti di evidenziazione. Con l'illuminazione ambientale ridotta al minimo, testare le luci a LED per garantire un'illuminazione epicardiale uniforme e massima, come determinato dalla profondità del pozzo del sensore.
Quindi, immagini il miocardio durante il ritmo del seno, la fibrillazione ventricolare o il stimolazione dinamico usando l'elettrodo di stimolazione posizionato sul ventricolo sinistro, iniziando con una lunghezza del ciclo di stimolazione di 350 millisecondi e diminuendo di 10-50 millisecondi per generare curve di restituzione. Per confermare l'acquisizione di un segnale ottico di qualità durante l'esperimento, aprire un file video, selezionare una regione di interesse e tracciare la fluorescenza media nel tempo. Alla fine dell'esperimento, rimuovere il cuore dal sistema e drenare il perfusato.
Quindi, sciacquare i tubi e le camere del sistema con acqua purificata. Per la manutenzione ordinaria, sciacquare periodicamente il sistema con la soluzione detergente in base alle esigenze. In questi studi rappresentativi, la procedura è stata eseguita su modelli intatti, come dimostrato, che variavano in dimensioni da 2,5 a 10,5 chilogrammi di peso corporeo e da 18 a 137 grammi di peso cardiaco.
Dopo aver trasferito il cuore isolato in un sistema Langendorff, la frequenza cardiaca si stabilizza a circa 70 battiti al minuto entro circa 10 minuti dalla defibrillazione e rimane costante per tutta la durata dello studio. Viene in genere misurata una portata media di circa 184 millilitri al minuto. Rallenta a 70 millilitri al minuto dopo aver perfuso con mezzo riscaldato contenente un disaccoppiatore meccanico.
Due ECG di piombo possono essere registrati per tutta la durata dello studio durante il ritmo del seno o in risposta al ritmo esterno per quantificare i parametri elettrofisiologici. Gli esperimenti di mappatura ottica possono anche essere eseguiti durante il ritmo del seno e la fibrillazione ventricolare spontanea. Le immagini rappresentative di un cuore carico di colorante possono essere ottenute con i corrispondenti potenziali di azione ottica.
E i transitori di calcio possono essere raccolti da due regioni di interesse sulla superficie epicardiale. Inoltre, la stimolazione epicardiale dinamica può essere utilizzata durante gli esperimenti di mappatura ottica per normalizzare eventuali lievi differenze nella frequenza cardiaca intrinseca. I segnali grezzi possono essere utilizzati per rappresentare il potenziale d'azione del tempo di accoppiamento transitorio del calcio, il tempo di attivazione e durata e la restituzione elettrica e del calcio.
È importante evitare di permettere alle bolle di entrare nell'aorta, ridurre al minimo il tempo di trasferimento dall'animale al sistema e sostenere il cuore più grande. L'elettrofisiologia e i dati del segnale ottico possono essere analizzati dopo l'acquisizione. Inoltre, il cuore può essere preservato dopo lo studio per l'istologia, l'immunostaining o l'analisi dell'espressione genica.
Stiamo usando questa tecnica per caratterizzare lo sviluppo cardiaco giovanile ed esaminare l'impatto delle esposizioni ambientali sulla fisiologia cardiaca. I disaccoppiatrici meccaniche utilizzati per ridurre al minimo il movimento e le sostanze chimiche anti-schiuma utilizzate per affrontare la schiuma dell'albumina sono entrambi tossici, quindi è assolutamente essenziale utilizzare gli adeguati dispositivi di protezione individuale.
