Одна из проблем в области жировой биологии заключается в поддержании зрелых адипоцитов в культуре. Мы разработали новый метод, который позволяет изучать долгосрочные адипоциты на протяжении больших изменений. Наша методика культуры адипоцитов позволяет изучать клеточные взаимодействия и, как мы надеемся, будет полезна для разработки новых методов лечения диабета и ожирения.
Важно внимательно следить за протоколом, так как есть некоторые важные шаги, которые сильно влияют на качество генов и жизнеспособность зрелых адипоцитов. Например, перед покрытием убедитесь, что все свободные липиды и мыть буфер был удален в противном случае липоциты могут сорвать, когда вставки перевернуты. Получив образец подкожной жировой ткани человека, поместите ткань в стерильный биологический шкаф безопасности в 15-сантиметровую чашку Петри.
Небольшой объем средних 199 к блюду. Используйте пинцет, чтобы захватить большие фиброзные сосуды в ткани и использовать заднюю часть кончика закрытой пары ножниц, чтобы аккуратно отказаться от жировой вдоль сосуда, чтобы освободить адипоцитов. Когда все клетки были собраны отказаться от больших кусков фиброзной ткани и взвесить обрезанный жир.
Для дальнейшего освобождения клеток от жировой ткани, передачи 10 граммов жировой ткани в новую 15-сантиметровую чашку Петри и использовать изогнутые ножницы, чтобы тщательно фарш жира, пока он не станет гладкой однородной смеси без больших кусочков жировой. Когда весь жир был обработан, используйте ложку, чтобы передать 10 миллилитров рубленой ткани в отдельные 50 миллилитров труб и добавить 30 миллилитров буфера пищеварения в каждой трубке. Затем поместите трубки в трясущимся инкубатором при 37 градусах Цельсия и 150 вращениях в минуту в течение 30-35 минут.
Пищеварение завершается, когда жировой раствор однороден, абрикосового цвета и отсутствует крупными кусочками. В конце пищеварения, декант усваивается жировой раствор в 250 микрометровый фильтр сетки внутри воронки, установленных в стерильной однолитровой колбе. Когда весь объем адипоцитов суспензии был ускользает, нежный сжать сетчатый фильтр, чтобы увеличить выход адипоцитов и мыть фильтр с 50 до 100 миллилитров мытья буфера, прежде чем сжать фильтр снова.
Перенесите изолированный раствор адипоцитов в разделительную воронку и добавьте буфер для мытья до тех пор, пока воронка не будет почти полностью заполнена. Аккуратно инвертировать воронку несколько раз, чтобы смешать адипоцит подвески с буфером и пусть подвеска стоять в течение двух-трех минут, пока не будет четкого разделения слоев. Когда слои отделятся, откройте сопло на воронке и медленно ускользнете от нижнего раствора в стерильную колбу.
Когда все коллагеназы были удалены, собирать очищенные зрелые жировые растворы в 50 миллилитров конических труб и слегка упаковать клетки центрифугации. Затем используйте 10 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 18 калибра, чтобы удалить оставшийся буфер мытья под подвеской адипоцитов и использовать пипетку, чтобы удалить свободный липидный слой, плавающий над зрелыми адипоцитами. Для посева зрелых адипоцитов поместите проницаемый мембранный компонент с ног на голову на стерильную поверхность и аккуратно инвертировать трубки упакованных адипоцитов несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
Используя широкий наконечник пипетки скважины, добавьте 30 микролитров упакованных зрелых адипоцитов на каждую мембрану. Инвертировать панель вставки одним плавным движением так, чтобы посеянные адипоциты были на дне вставок. Поместите панель вставок в пластину из 24 хорошо, содержащую от 500 до 1000 микролитров полной 37 градусов по Цельсию среды на колодец.
Затем накройте тарелку и аккуратно поместите тарелку в инкубатор культуры тканей. Каждые семь дней культуры, заменить среду через вырез отверстие в каждой вставке. После одной недели культуры, зрелые адипоциты агрегаты изолированы от подкожной жировой ткани поддерживать характерные неилокулярные липидные капли морфологии наблюдается только в зрелых адипоцитов.
Лечение агонистами PPAR-GAMMA pioglitazone и rosiglitazone приводит к увеличению экспрессии в отзывчивых генах PPAR-GAMMA, в то время как лечение глюкокортикоидным рецептором агониста дексаметазона не влияет на эти гены. Аналогичным образом, агонист глюкокортикоидных рецепторов надежно управляет экспрессией генов-мишеней глюкокортикоидных рецепторов, в то время как агонисты PPAR-GAMMA не имеют существенного влияния на эти гены. Кроме того, семидневное лечение агонистами PPAR-GAMMA надежно индуцирует экспрессию генов конкретного гена коричневого жира, UCP1.
Наша новая модель адипоцитов in vitro может быть использована для функциональных исследований в зрелых адипоцитах, включая поглощение глюкозы, липогенез и липолиз. С помощью этой новой техники культуры адипоцитов мы смогли показать, что зрелые белые адипоциты человека могут трансдифференцированы в коричневые адипоциты.
