Этот протокол направлен на использование органоидов мозга для изучения митохондриальных заболеваний. Он был разработан для генерации воспроизводимых органоидов мозга при оценке их митохондриальных свойств. Этот метод не требует дорогостоящих биореакторов и трудоемких процедур встраивания.
Поэтому он прост в реализации и высококлассный. Этот протокол позволяет генерировать воспроизводимые органоиды мозга и проверять их митохондриальные свойства. Это может привести к выявлению интервенционных целей для неизлечимых заболеваний митохондрий.
Для начала культивируйте человеческие ИПСК в условиях, свободных от фидера, в среде iPSC на покрытых шестилуночными пластинах и храните их в инкубаторе культуры увлажненной ткани при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Прохождение иПСК при 80% слиянии с использованием безферментной отслойной среды в соотношениях от одного на четыре до одного на 12. Чтобы увеличить выживаемость клеток, добавляйте 10 микромолярной ро-ассоциированной протеинкиназы или ингибитора ROCK после каждого расщепления.
Диссоциация 80% IPSC в нулевой день. Подготовьте кортикальную дифференцировочную среду один или CDM1 и предварительно разогрейте ее при комнатной температуре перед добавлением в клетки. Промывайте колодцы, содержащие ИПСК с PBS, чтобы удалить мертвые клетки и мусор.
Добавьте в каждую лунку 500 микролитров предварительно разогретого реагента А и инкубируйте в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться в отсоединении клеток. Добавляют один миллилитр среды iPSC для разбавления реагента А для нейтрализации его активности.
Используйте пипетку объемом 1000 микролитров для диссоциации клеток путем движения вверх и вниз и переноса клеточной суспензии в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Осторожно центрифугируйте иПСК в 125 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре, затем осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не потревожить гранулу клетки. Повторно суспендируют гранулу одним миллилитром CDM1 для получения одноклеточной суспензии и подсчета номера ячейки.
Подготовьте посадочную среду с 9 000 иПСК на 100 микролитров в CDM1, дополненную 20 микромолярным ингибитором ROCK, тремя микромолярными ингибиторами катенина WNT или IWR-1 и пятью микромоляриями SB-431542. Добавьте 100 микролитров посевной среды на скважину к нижней пластине с 96 В. Храните пластину в инкубаторе культуры увлажненной ткани при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа.
Чтобы создать невросферы, в первый день наблюдайте, что формируются круглые клеточные агрегаты с определенными гладкими границами. Обратите внимание на мертвые клетки вокруг агрегатов. Продолжают культивировать в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
На третий день перемешайте пластину, постукивая по бокам три раза, чтобы отделить мертвые клетки, затем добавьте 100 микролитров CDM1, дополненных 20 микромолярными ингибиторами ROCK, тремя микромоляльными IWR-1 и пятью микромоляриями SB-431542 в каждую лунку. Держите пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа. На шестой день аккуратно извлеките из каждой лунки по 80 микролитров надосадочной среды.
Избегайте прикосновения к дну колодца. Добавьте 100 микролитров CDM1 с добавлением трех микромоляров IWR-1 и пяти микромоляров SB-431542 в каждую лунку и инкубируйте пластину. Повторяйте предыдущий шаг каждые три дня до 18-го дня.
На 18-й день для переноса невросферы приготовьте CDM2 и добавьте 10 миллилитров к 100-миллиметровой ультранизкой пластине культивирования клеток. Используйте 200-микролитровую пипетку с отрезанным наконечником, чтобы перенести круглые невросферы с 96-луночной пластины на 100-миллиметровую пластину для культивирования клеток со сверхнизким прикреплением. Удалите пять миллилитров среды из пластины, содержащей невросферы, и добавьте пять миллилитров свежего CDM2.
Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 70 оборотов в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Каждые три дня тщательно аспирируйте надосадочную среду и заменяйте ее свежим CDM2. Оставьте небольшое количество среды, чтобы предотвратить высыхание невросфер.
На 35-й день подготовьте CDM3. Аспирировать среду с пластины и добавить 10 миллилитров холодного CDM3. После изменения среды поместите пластину обратно на орбитальный шейкер со скоростью 70 оборотов в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Меняйте среду каждые три-пять дней в зависимости от скорости роста, на которую указывает цвет среды. На 70-й день подготовьте CDM4. Используйте среду CDM4 до тех пор, пока не будет достигнут желаемый возраст органоидов.
В течение этого периода держите пластину на орбитальном шейкере, установленном со скоростью 70 оборотов в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Меняйте среду каждые три-пять дней в зависимости от темпов роста. Подготовьте раствор 4% PFA и поместите его под защитную оболочку.
Соберите органоиды мозга и аккуратно перенесите их тупой трехмиллилитровой пластиковой пипеткой Пастера в шестилуночную пластину, заполненную PFA. Держите органоиды в растворе PFA в течение одного часа при комнатной температуре. Осторожно удалите PFA с помощью трехмиллилитровой пластиковой пипетки Пастера и трижды вымойте неподвижные органоиды с помощью PBS.
Храните фиксированные органоиды при четырех градусах Цельсия в PBS до дальнейшего использования. Органоиды, генерируемые с использованием этого протокола, содержат зрелые нейроны, которые можно визуализировать с помощью белковых маркеров, специфичных для аксонов и дендритов. Зрелые органоиды содержат не только нейрональные клетки, но и глиальные клетки.
Используя анализ срезанных органоидов головного мозга, можно контролировать положительные аксоны SMI 312 и положительные дендриты MAP2 или бета-глиальные клетки S100. Кроме того, конфокальные изображения помогают исследовать подробное распределение и организацию положительных нейронных предшественников SOX2 по отношению к бета-3 тубулин-положительным нейронам. Органоиды головного мозга окрашивали для митохондрий-специфических маркеров, таких как транслоказ наружной мембраны или TOM20.
Биоэнергетическое профилирование органоидов головного мозга проводили путем измерения как митохондриального метаболизма с использованием скорости потребления кислорода, или OCR, так и гликолитического метаболизма с использованием скорости внеклеточного подкисления, или ECAR. Олигомицин вызывает падение профиля OCR и, следовательно, идентифицирует OCR, необходимый для производства АТФ. При лечении олигомицином также может наблюдаться компенсаторное увеличение ECAR, предполагающее, что клетки могут повышать гликолиз для предотвращения метаболического стресса.
При переносе невросфер с 96-луночной пластины на культуральную пластину или во время процедуры фиксации крайне важно осторожно обращаться с органоидами, чтобы не повредить их. После генерации органоидов мозга мультиэлектродная матрица или кальциевая визуализация были бы идеальными методами для проверки функциональности органоидов.
