С помощью этого протокола исследователи могут определить новые экзома или внеклеточной везикулы на основе и ткани на основе микро-клеток для продвинутого рака предстательной железы. Изолировать РНК как от тканей F-F-B, так и от внеклеточных пузырьков часто является сложной задачей, так как большая ее часть либо де-создана, либо находится в ограниченном количестве Эта частица будет разрабатывать различные методы оптимизации входов R-N-A и библиотек C-D-N-A для генирования наиболее специфических свободных и высококачественных данных для секвенирования следующего поколения. Следующее секвенирование гена предлагает наиболее полную платформу для понимания изменения молекулы в опухоли, которая лежат в основе прогрессирования опухоли, эта частица оптимизирована с клиническим образцом рака простаты, и может обеспечить новое понимание основной биологии продвинутого агрессивного рака простаты.
Оптимизация библиотек C-D-N-A из низкого входного материала является важным шагом для успешного времени секвенирования, поэтому очень важно создавать высококачественные библиотеки C-D-N-A для получения точных результатов. После выполнения микро рассечения тканей, как это было ранее сделано приступить к изоляции сыворотки, полученных E-V в оттепель ряды пациентов образцов сыворотки на четыре градуса по Цельсию. Перенесите 110 микролитров разморожевания образца сыворотки в трубку и вращайся по две тысячи раз G в течение тридцати минут.
Выбрайте супер naden для последующего E-V или экзосомы изоляции и отказаться от debree гранулы. На 30 микролетеров сыворотки экзосомы изоляционный реагент к супер natent. Инкубировать его четыре градуса по Цельсию в течение тридцати минут.
Спин при десяти тысячах раз G в течение десяти минут. Избрать E-V супер nadent тщательно, не нарушая гранулы в отдельной 1,5 миллилитровой трубки и хранить минус 80 градусов по Цельсию для будущего анализа. Затем повторно приостановить E-V гранулы в 70 микролитров P-B-S подготовлены в нуклеазы свободной воды.
После изоляции общего R-N-A от микро вскрытых тканей, и очищенные E-V с использованием коммерческих комплектов выполнять библиотека Подготовка в пять микролитров нормализованных сорок нанограмм на микро-литровый R-N-A образца на один микро-литр из трех основных адаптер. Предварительно разогреть тепловой циклер до 70 градусов по Цельсию и инкубировать образец в течение двух минут. Немедленно перенесите образцы на лед.
В отдельной трубке смешивают два микролитров буфера перевязки, один микро-литр ингибитора RNase и один микро-литр T4 РНК-лигазы два, удаление мутанта. Смешайте свидания пирог постельных принадлежностей вверх и вниз. Затем добавьте четыре микролитров смеси в трубку с R-N-A 3 премьер адаптер на льду.
Разогреть тепловой циклер до 28 градусов по Цельсию. И поместите трубку в тепловой циклер, чтобы инкубировать в течение одного часа. После этого добавьте один микро-литр стоп-раствора в трубку, сохраняя при этом образец на тепловом циклере.
Инкубировать при 28 градусах по Цельсию еще 15 минут. Затем немедленно снимите трубку и держите на льду. В отдельную трубку добавить один микролитер из пяти премьер адаптер.
Перенесите на термальный циклер, который был разогрет до 70 градусов по Цельсию. И инкубировать в течение двух минут. Немедленно поместите трубку на лед, чтобы предотвратить реаннеалирование адаптеров.
Добавьте один микролитр из десяти миллимол A-T-P в трубку D natured пять основных адаптер. Смешайте до свидания пирог pedding и добавить один микро-литр T4 R-N-A лигазы в смеси. Смешайте до свидания пирог pedding.
Перенесите три микролитера этой смеси в трубку, содержащую три основных адаптера, перевязав R-N-A. Поместите трубку на тепловой циклер, который был предварительно нагревается до 28 градусов по Цельсию и инкубировать в течение одного часа. После этого немедленно перенесите трубку на лед и либо пронесите дальше с образцами, либо храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.
Для выполнения R-T-P-C-R используйте шесть микролигеров каждого адаптера с перевязав R-N-A и добавьте к нему один микролигер R-N-A R-T. Перенесите трубку на термальный циклор, разогретый до 70 градусов по Цельсию и инкубировать в течение двух минут. Перенесите трубку на лед.
В отдельной трубке смешивают два микролитров 5X, буфер пряди, 5 микролитров 12,5 милимолеров DNTP, один микролитер 100 милимолярных DTT, один микролитер ингибитора R-N-A и один микролитер обратной транскриптазы. Добавьте пять микролитров этой смеси к адаптеру перевязанной РНК и перенесите его в тепловой циклер, который был разогрет до 50 градусов по Цельсию, чтобы инкубировать в течение одного часа. После одного часа передачи адаптера перевязанные бесплатные ДНК сразу на лед.
В отдельной трубке смешайте 25 микролитров смеси ПЦР, два микролитров грунтовки РНК PCR, два микролитров индекса грунтовки РНК PCR и 8,5 микролитров свободной воды РНК. Добавьте 37,5 микролитров этой смеси в 12,5 микролитров адаптера с перевязав cdNA. Перенесите трубку на теплотрассу, которая была разогрета до 98 градусов по Цельсию.
Программа теплового цикла, как это предлагается в протоколе производителя с номером цикла изменен до 15. После завершения, держать образец на четыре градуса по Цельсию. Продолжить или хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
Чтобы очистить перевязанные бесплатные ДНК, добавить десять микролитров ДНК загрузки красителя для каждого бесплатного образца ДНК. И до десяти микролитров с высоким разрешением последнего и пользовательских РНК последнего. Вы запустите 30 микролитров каждого образца в двух отдельных полосах, прилегающих друг к другу в шестипроцентный гель TBE Polyacrylamide.
С пользовательскими РНК последнего и с высоким разрешением последнего, промежуточное пространство между двумя различными образцами. Запустите гель в одном буфере X TBE на 145 вольт в течение примерно 30 до 40 минут. Следите за нижней синей передней части погрузочного красителя.
Остановите электрофорез, когда он приближается к нижней части геля. Перенесите гель в один буфер X TBE с 5 микрограммами на миллиметр бромистого этидия. Визуализуйте гель в трансиллюминаторе и вырежьте гель точно между 145 базовой парой и 160 маркерами базовой пары и чуть выше маркера 145 базовых пар, чтобы избежать загрязнения адаптерным димером.
Важным шагом является очистка ligated CDNA, что делается путем резки гель точно так же, как адаптер димеры запустить очень потерять желаемого бренда. Перенесите кусочки геля в трубки для разрушения ДНК, которые хранятся в двухмиллиметровых трубках для сбора. Спин при 20 тысячах раз G в течение двух минут.
И добавить триста микролитров воды без RNase и дать ему мягко вращаться на рокер ночь при комнатной температуре. Для выполнения ДНК осадков на следующий день перенос содержимого трубки в 5 микрон фильтруных трубок. Спин 600 раз G в течение строго десяти секунд.
Затем добавьте два микролитера гликогена тридцать микролитров трех ацетатов молярного натрия, 1X гранулы краски, и 975 микролитров 100 процентов этанола в элайт ДНК. Спин при 17 000 раз G при 4 градусах Цельсия в течение 20 минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте 75 процентов этанола для мытья гранул.
После вращения при 17 тысячах раз G при четырех градусах цельсия в течение пяти минут отбрасывают супернатант и инкубируют трубки при 37 градусах по Цельсию, на тепловом блоке полностью испаряется этанол. Re приостановить гранулы с 12 микролитров 10 миллимолярный хлорид трицида при PH 8.5. Далее выполните проверку качества библиотеки, разбавляя очищенную и бесплатную ДНК десять раз и используя один микролитер разбавленного CDNA для работы на биоанализе.
Убедитесь, что бесплатный размер продукта ДНК соответствует диапазону малых РНК в электроферограмме между 136 и 160 базовыми парами. Рассчитайте общую молярность для каждого образца. Нормализуйте каждый образец до 2 наномоляров с использованием трис гидрохлорида на PH 8.5.
Держите библиотеки, смешивая равные объемы каждого из двух наномолярных образцов в одной двести микролитров ПЦР трубки. Денатура и последовательность следуя шагам, описанным в рукописи. В этом исследовании библиотека была подготовлена после изоляции РНК и проверки качества.
Размер продукта для адаптера лигатированных микро Rnase соответствовал около 136 до 160 базовых пар для каждого образца. Выделенные разделы показывают диапазон геля, который был точно вырезан для небольшой библиотеки РНК подготовки. На этом рисунке показаны гель-электрофорез и электроферограммы для очищенной бесплатной библиотеки ДНК.
Микро вскрытые ткани FFPE и сыворотки, полученные EV's. Репрезентативные метрики из небольшого запуска секвенирования РНК демонстрируют ожидаемую плотность кластера, оценка, процент прохождения кластера, а также расчетную урожайность и погрешность микро рассеченных тканей FFP и сыворотки, полученных EV. Оценка качества в обоих образцах показала значение выше трех, указывающее на 99,9 процента точности базового вызова.
И показатели ошибок были ниже одного. Каждый шаг в подготовке библиотеки должен быть тщательно выполнен и трубы должны быть немедленно переданы на лед после каждого инкубации. Важным шагом в протоколе является резки гель именно для того, чтобы у вас есть адаптер димер бесплатно и чисто CDNA библиотеки.
Создание библиотеки CDNA требует оптимизации для высококачественного секвенирования. Понимание этого протокола поможет зрителям экстраполировать эти мельчайшие детали на другие секвенирования библиотеки prepration из ограниченного источника образцов предложить сыворотки и внеклеточных пузырьков. Этот метод помог нам в выявлении новых микроназ, которые связаны с туморатной агрессивностью и устойчивостью к терапии у пациентов с метастатическим раком простаты.
Эти методы могут экстраполировать на другие типы заболеваний, которые могут помочь в открытии нового биомаркера. Поскольку этот метод использует биологические материалы, такие как полосатые производные образцы сыворотки и тканей, следует принять соответствующие меры предосторожности. Кроме того, бромид этидия является известным канцерогеном и должен быть очень тщательно обработан с помощью этого протокола.
