Этот метод представляет собой часть более крупного протокола сохранения ex situ, используемого для лабораторного массового производства бабочек, представляющих риск. Он иллюстрирует, как основные методы земледелия могут быть адаптированы для научных исследований, чтобы помочь решить ключевые поведенческие, история жизни, или экологические пробелы данных. Конкретные методы, представленные для оценки времени разработки личинок и количество личинородных стадионов имеют широкую применимость к другим программам сохранения бабочек или научно-исследовательских программ.
Этот метод является эффективным подходом для документирования показателей истории жизни находящихся под угрозой исчезновения бабочек, таких как количество личинок instars, продолжительность стадий развития, и размер всех стадий жизни. Мы упростили наш протокол, чтобы повысить производительность и эффективность в лаборатории, что особенно важно при сборе данных в короткие сроки. Этот метод требует ловкости и внимания к деталям, чтобы избежать вреда организма, так как личинки бабочек очень малы, особенно как новорожденные.
Демонстрацией процедуры будет Джейкоб Хорнфельдт, студент нашей лаборатории. Для начала используйте небольшую верблюжью акварель для волос, чтобы тщательно переместить и изолировать одну личинку и поместить ее под рассеченный микроскоп в чашку Петри. Опустите одну волоску пера насекомого в нетоксическую светящуюся краску контрастного цвета с личинкой и аккуратно положите одну маленькую каплю краски на заднюю часть личинки.
Через 30 секунд краска высыхает. С помощью небольшой верблюжьей волосы акварели кисть, место каждого отдельного личинки в своей собственной две унции ясно пластиковые части чашки, содержащие примерно один-три небольших листьев свежего материала терминала хозяина, и написать уникальный идентификатор на чашку и крышку. Твердо закретуте крышку.
Тщательно проверяйте каждую личинку ежедневно. С помощью типсов снимите листья и установите их на белую поверхность. Осмотрите чашку и чистую крышку.
Изучите листья под рассекающий микроскоп на наличие личинок exuviae и головы капсулы. При наблюдении личинки exuvia, удалите его из чашки и поместите его во флакон, наполненный 0,2 микролитров глицерина. Этикетка верхней части крышки и стороны с номером личинки, дата линьки, и головной капсулы.
Поместите личинку exuvia и связанные с ней капсулы головы в хмяковую пластиковую крышку чашки части, и положить пару капель этанола в нем. Наблюдайте за личинкой exuvia под рассеченным микроскопом. Если личинка головной капсулы уже отделена от экзувии, поместите каплю глицерина на кончик остроконечных антимологических типсов и аккуратно коснитесь головной капсулы к глицерину.
Поместите головную капсулу в сопутствоволивую микроцентрифугную трубку. Если головная капсула все еще прикреплена к личинке exuvia, используйте остроконечные миппы и булавку насекомого, чтобы отделить капсулу головы от личинки exuvia. После того, как он отделен использовать технику глицерина, чтобы забрать голову капсулы.
После каждой линьки перекрашивают личинки и записывают линьки. Каждый день используйте цифровые калиперы для измерения общей длины тела от головы до последнего брюшного сегмента каждой личинки. Возьмите три измерения и записывают среднее значение этих трех измерений вместе с датой и временем.
Проверьте соответствующий пластиковый стаканчик, чтобы убедиться, что нет плесени в нем. Удалите все фрагменты и старый мусор хозяина и добавить свежий материал хозяина по мере необходимости. Верните личинку в чашку.
Поддерживайте чашки при лабораторной температуре от 27 до 32 градусов по Цельсию для оптимальной личиновой активности и развития. Поддерживайте состояние до тех пор, пока все личинки не достигнут своей конечной звезды и не начнут подготовительную стадию. Когда личинки перестанут кормиться, поверните однородный туповато-зеленовато-коричневый цвет, потеряете свои шевроны и часто блуждайте от хозяина, поместите небольшой кусочек гофрированной бумаги в чашку.
После того, как каждая личинка полностью окуклина измерить его общую длину и записать дату окукливания. Это окончательная линьки каждого человека. Проверяйте куколки ежедневно.
Когда они выросли в бабочек, использовать миппы, чтобы держать взрослую бабочку и мягко удар по крыльям, чтобы выявить верхний цвет поверхности крыла. Мужчины, как представляется, синий по всему крылья и женщины сократили синий и оранжевый глаз на заднее крыло. Завехать дату выкупа и пол каждой полученной взрослой бабочки.
Для измерения длины аккорда крыла каждая бабочка осторожно держит бабочку с типсами и использует цифровые калиперы. В случае, если бабочка слишком активна, чтобы быть измерены поместите его в холодильник в течение 30 секунд или меньше, и попробуйте еще раз. Этот протокол позволил провести исследования и провести обширный сбор данных о многочисленных ключевых пробелах в данных, важных для совершенствования наилучшей практики лабораторного разведения и животноводства.
Вот четыре головные капсулы, собранные для одного человека. Большинство личинок имели четыре линьки с каждой незрелой стадии жизни менее пяти дней. Самки обычно развивались быстрее на всех незрелых стадиях по сравнению с самцами.
Хотя это не было значительным эффектом с значением p на 0.625. Этот шаг очень дотошный, особенно когда личинки свежевылупившихся новорожденных. Важно помнить, чтобы использовать микроскоп во время этого шага, чтобы убедиться, что краска наносится на соответствующее место на задней гусеницы.
Эти методы могут быть расширены, чтобы помочь оценить показатели выживаемости на стадии развития, дифференциальную производительность на нескольких личиночинок хостов, а также помочь исследователям лучше интерпретировать данные с места. Этот простой метод иллюстрирует, как с небольшим планированием основных методов управления организмом могут быть легко адаптированы для научных исследований. Результаты могут быть использованы, чтобы помочь информировать, и потенциально адаптировать, ex situ методы для повышения успеха.
