Este método representa uma porção de um protocolo maior de reprodução de conservação ex situ usado para a produção em massa laboratorial de borboletas em risco. Ilustra como métodos básicos de criação podem ser adaptados para pesquisas científicas para ajudar a abordar as principais lacunas comportamentais, de vida ou de dados ecológicos. Os métodos específicos apresentados para avaliar o tempo de desenvolvimento larval e o número de estádios larvais têm ampla aplicabilidade a outros programas de conservação ou pesquisa de conservação de borboletas.
Esta técnica é uma abordagem eficaz para documentar as métricas da história de vida de uma borboleta ameaçada, como número de instars larval, duração dos estágios de desenvolvimento e tamanho de todas as fases da vida. Simplificamos nosso protocolo para que a produtividade e a eficiência possam ser aumentadas no laboratório, o que é especialmente importante na coleta de dados em um curto espaço de tempo. Este método requer destreza e atenção aos detalhes para evitar danos ao organismo, já que as larvas de borboleta são muito pequenas especialmente como os recém-nascidos.
Demonstrando o procedimento será Jacob Hornfeldt, um estudante do nosso laboratório. Para começar, use um pequeno pincel de aquarela de cabelo de camelo para mover cuidadosamente e isolar uma única larva e colocá-la sob um microscópio dissecando em uma placa de petri. Mergulhe um único cabelo da caneta de inseto em tinta luminosa nãotóxica de cor contrastante à da larva, e cuidadosamente coloque uma pequena gota de tinta na parte de trás da larva.
Depois de 30 segundos, a tinta seca. Com a ajuda de um pequeno pincel de aquarela de cabelo de camelo, coloque cada larva individual em seu próprio copo de porção de plástico transparente de duas onças contendo aproximadamente uma a três pequenas folhas de material hospedeiro terminal fresco, e escreva um identificador único no copo e na tampa. Segure firmemente a tampa.
Verifique cuidadosamente cada larva diariamente. Com fórceps, remova as folhas e coloque-as em uma superfície branca. Inspecione o copo e a tampa clara.
Examine as folhas sob um microscópio dissecando para a presença de exuviae larval e cápsulas da cabeça. Quando uma exuvia larval for observada, remova-a do copo e coloque-a em um frasco cheio de 0,2 microliters de glicerina. Rotule a parte superior da tampa e o lado com o número da larva, data de molt e cápsula da cabeça.
Coloque a exuvia larval e a cápsula da cabeça associada em uma tampa de copo de porção de plástico transparente, e coloque algumas gotas de etanol nela. Observe a exuvia larval sob um microscópio dissecando. Se a cápsula da cabeça larval já estiver separada da exuvia, coloque uma gota de glicerina na ponta de fórceps enticológicos pontiagudos e toque suavemente na cápsula da cabeça para a glicerina.
Coloque a cápsula da cabeça no tubo de microcentrifuuagem associado. Se a cápsula da cabeça ainda estiver presa à exuvia larval, use fórceps pontiagudos e um pino de inseto para separar a cápsula da cabeça da exuvia larval. Uma vez separados use a técnica de glicerina para pegar a cápsula da cabeça.
Após cada molt, repine as larvas e regise as datas de molt. Todos os dias, use pinças digitais para medir o comprimento total do corpo da cabeça até o último segmento abdominal de cada larva. Faça três medições e regise a média dos três junto com a data e a hora.
Verifique o copo de plástico correspondente para ter certeza de que não há nele. Remova todos os detritos frass e antigos do hospedeiro e adicione material hospedeiro fresco conforme necessário. Devolva a larva para o copo.
Mantenha os copos sob temperatura laboratorial entre 27 e 32 graus Celsius para atividade e desenvolvimento larval ideal. Mantenha a condição até que todas as larvas atinjam sua instar final e iniciem a fase prepupal. Quando as larvas pararem de se alimentar, vire uma cor marrom-esverdeada uniforme, perca seus chevrons, e muitas vezes vagueie fora do hospedeiro, coloque um pequeno pedaço de papel ondulado no copo.
Uma vez que cada larva tenha totalmente filhotes, meça seu comprimento total e regise a data da pupação. Este é o último molt de cada indivíduo. Verifique a pupae diariamente.
Quando crescerem em borboletas, use fórceps para segurar a borboleta adulta e golpear suavemente as asas para revelar a cor da superfície da asa superior. Os machos parecem ter azul por todas as asas e as fêmeas reduziram o azul e uma mancha de olhos laranja na asa traseira. Regisso tempo de eclosão e sexo de cada borboleta adulta resultante.
Para medir o comprimento do acorde da asa de cada borboleta segure suavemente a borboleta com fórceps e use pinças digitais. Caso a borboleta esteja muito ativa para ser medida coloque-a em uma geladeira por 30 segundos ou menos e tente novamente. Este protocolo permitiu pesquisas direcionadas e ampla coleta de dados sobre inúmeras lacunas de dados importantes para melhorar as melhores práticas de criação e criação de laboratórios.
Aqui estão as quatro cápsulas de cabeça coletadas para um indivíduo. A maioria das larvas tinha quatro molts a cada estágio de vida imaturo em menos de cinco dias. As fêmeas tipicamente se desenvolveram mais rapidamente em todos os estágios imaturos em comparação com os machos.
Embora este não tenha sido um efeito significativo com um valor p em 0,625. Este passo é muito meticuloso, especialmente quando as larvas são recém-eclodidas recém-eclodidas. É importante lembrar de usar um microscópio durante esta etapa para garantir que a tinta seja aplicada no lugar apropriado na parte de trás da lagarta.
Esses métodos podem ser expandidos para ajudar a avaliar as taxas de sobrevivência em estágio de desenvolvimento, o desempenho diferencial em vários hospedeiros larvais, bem como ajudar os pesquisadores a interpretar melhor os dados do campo. Este método simples ilustra como com um pouco de planejamento as práticas básicas de criação de organismos podem ser prontamente adaptadas para pesquisas científicas. Os resultados podem então ser usados para ajudar a informar e, potencialmente, adaptar métodos ex situ para melhorar o sucesso.
